自體造血干細(xì)胞移植治療狼瘡性腎炎外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化與臨床療效

任貴生 黃湘華 王慶文 陳文萃 劉正釗 章海濤 劉志紅 胡偉新

自體造血干細(xì)胞移植治療狼瘡性腎炎外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化與臨床療效

任貴生 黃湘華 王慶文 陳文萃 劉正釗 章海濤 劉志紅 胡偉新

目的：探討自體造血干細(xì)胞移植(ASCT)治療頑固性狼瘡性腎炎(LN)外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化及其與臨床療效的關(guān)系。 方法：選取2011年6月至2014年6月間18例經(jīng)免疫抑制治療未緩解或反復(fù)復(fù)發(fā)的頑固性LN患者接受ASCT治療。環(huán)磷酰胺(CTX)聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子行干細(xì)胞動(dòng)員，CTX聯(lián)合抗胸腺球蛋白多克隆抗體預(yù)處理。觀察ASCT治療后外周血CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+比值、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)和CD20+B細(xì)胞的變化及其與臨床療效的關(guān)系。 結(jié)果：ASCT治療后系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)(SLE-DAI)、尿蛋白和自身抗體陽性率顯著下降，血清白蛋白和補(bǔ)體水平顯著升高。采集后，患者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降，回輸后出現(xiàn)上升，回輸后12個(gè)月、18個(gè)月CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)高于采集前，各時(shí)間點(diǎn)CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于采集前；回輸后CD4+/CD8+比值持續(xù)倒置，患者CD4+CD25+Treg計(jì)數(shù)顯著增加。采集后，患者CD20+B細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降，回輸后快速增加。 結(jié)論：ASCT治療頑固性狼瘡性腎炎有顯著療效，但淋巴細(xì)胞亞群失衡持續(xù)存在，CD4+CD25+Treg計(jì)數(shù)增加可能在治療中發(fā)揮重要作用；6個(gè)月后CD20+B細(xì)胞增加伴隨自身抗體水平升高，表明抗B細(xì)胞治療的必要性。

狼瘡性腎炎 自體造血干細(xì)胞移植 淋巴細(xì)胞亞群

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是常見的自身免疫性疾病，可導(dǎo)致腎、關(guān)節(jié)、血液系統(tǒng)、腦等多系統(tǒng)的損傷，其中腎臟受累即狼瘡性腎炎(LN)與SLE的預(yù)后關(guān)系密切。盡管激素及細(xì)胞毒藥物的應(yīng)用改善了LN患者的預(yù)后，但仍有部分患者反應(yīng)欠佳，而藥物的不良反應(yīng)也限制了免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用。1993年，Marmont[1]首先提出造血干細(xì)胞移植有可能用于治療SLE，1996年自體造血干細(xì)胞移植(ASCT)治療SLE首次在臨床實(shí)施[2]。ASCT治療SLE及LN的有效性和安全性已經(jīng)得到證實(shí)[3-4]。我們的研究表明，ASCT治療重型LN的總緩解率為85%，患者的3年生存率為90%[5]。

在SLE及LN的發(fā)病中，外周血淋巴細(xì)胞的異常起到重要作用。機(jī)體在多種因素作用下，正常的自身免疫耐受被破壞，B細(xì)胞過度增殖并功能亢進(jìn)，產(chǎn)生多種自身抗體，損傷自身組織。T細(xì)胞異常為B細(xì)胞活化提供了基礎(chǔ)，并起到誘導(dǎo)作用。成熟T細(xì)胞分為CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)、CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。CD4+Th細(xì)胞可以分泌不同的細(xì)胞因子作用于其他細(xì)胞，影響它們的功能。CD8+CTL則通過釋放顆粒酶或FasL/Fas通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞免疫效應(yīng)[6]。目前，有關(guān)淋巴細(xì)胞在ASCT治療LN前后的變化及這樣的變化在治療中所起作用的研究甚少。本文回顧性觀察了ASCT治療18例重型LN患者的臨床療效及患者淋巴細(xì)胞亞群的變化，并分析了兩者間可能存在的聯(lián)系。

對(duì)象和方法

病例選擇 2011年6月至2014年6月在我科行ASCT的重型LN患者18例。診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1997年的修訂SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，并計(jì)算SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLE-DAI)[8]。在ASCT前行腎活檢明確病理類型(2003年ISN/RPS分型標(biāo)準(zhǔn))[9]，并行腎組織活動(dòng)性指數(shù)(AI)、腎組織慢性指數(shù)(CI)評(píng)分。

納入標(biāo)準(zhǔn) (1)年齡在18～50歲；(2)復(fù)發(fā)或難治性LN，腎活檢證實(shí)為重型LN，且提示腎臟活動(dòng)性病變；(3)血清肌酐(SCr)<176.8 μmol/L；(4)無心肺等重要器官禁忌；(5)患者及其家屬移植意愿強(qiáng)烈。

排除標(biāo)準(zhǔn) (1)活動(dòng)性感染；(2)腎臟病理慢性化病變重，CI≥3分；(3)心功能NYHA分級(jí)3/4級(jí)；(4)氧合功能不佳，不吸氧時(shí)氧飽和度<95%。

免疫藥物治療方案 采集和回輸前后停用其余免疫抑制劑，僅用潑尼松治療(10～20 mg/d)。自體造血干細(xì)胞(ASC)植入后，如病情持續(xù)緩解，則潑尼松逐漸減量至停用；如臨床有復(fù)發(fā)趨勢(shì)，則予小劑量潑尼松聯(lián)合免疫抑制劑治療，包括他克莫司、霉酚酸酯和雷公藤多苷。

ASC的動(dòng)員和采集 使用環(huán)磷酰胺(CTX)聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員，CTX 3～4 g/m2，分兩天使用。從CTX使用后第四天開始，G-CSF 200 μg/d。于白細(xì)胞計(jì)數(shù)升至>4×109/L時(shí)行CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)。當(dāng)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)>15個(gè)/μl時(shí)開始采集。采集目標(biāo)量為CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)>2×106個(gè)/kg。

預(yù)處理及ASC的回輸 在采集后1個(gè)月行ASC回輸?；剌斍笆褂肅TX聯(lián)合抗胸腺球蛋白多克隆抗體(ATG)預(yù)處理。CTX劑量30～40 mg/(kg·d)，ASC回輸前2～5d連續(xù)4d，ATG劑量2.5 mg/(kg·d)，ASC回輸前2～4d連續(xù)3d，同時(shí)水化、堿化。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法復(fù)蘇干細(xì)胞，經(jīng)頸內(nèi)靜脈置管快速回輸?；剌敽蟮?天開始使用G-CSF。

淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 使用的主要試劑為CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，CD20-FITC，CD19-PE，CD25-PC5，CD127-PE，CD4-FITC(美國(guó)BECKMAN COULTER公司)。標(biāo)本管加入對(duì)應(yīng)試劑10 μl，再加入全血50 μl，混勻后置室溫避光孵育20 min，溶血，固定。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的指標(biāo)包括CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)(參考值651±274個(gè)/μl)、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)(參考值453±211個(gè)/μl)、CD4+T細(xì)胞比例(參考值41.0%±7.1%)、CD8+T細(xì)胞比例(參考值28.2%±6.3%)、CD4+/CD8+比值(參考值1.6±0.6)、CD4+CD25+Treg計(jì)數(shù)(參考值33±9個(gè)/μl)、CD4+CD25+Treg比例(參考值2.1%±0.6%)、CD20+B細(xì)胞計(jì)數(shù)(參考值125±52個(gè)/μl)、CD20+B細(xì)胞比例(參考值11.0%±2.9%)。

臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 包括SLE-DAI，SCr(參考值45.1～109.6 μmol/L)，ANA和抗-dsDNA，血清白蛋白(Alb)(參考值35～55 g/L)，尿蛋白定量(參考值≤0.4 g/24h)和尿沉渣紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)(參考值0.8～1.0萬/ml)。

療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)和無效(NR)。CR定義為：尿蛋白定量≤0.4 g/d，無活動(dòng)性尿沉渣(尿RBC正常范圍，無白細(xì)胞尿及管型尿)，Alb≥35 g/L，SCr<109.6 μmol/L，無腎外狼瘡活動(dòng)；PR定義為：尿蛋白定量下降超過基線值的50%且<3.5 g/d，Alb≥30 g/L，SCr正?；蛏仙怀^基礎(chǔ)值的25%；未達(dá)到CR或PR則定義為NR。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示；計(jì)數(shù)資料采用病例數(shù)和(或)百分?jǐn)?shù)描述，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況 18例患者中男性8例，女性10例，年齡24.5(19.2～31.5)歲。采集前狼瘡病程45.5(24.5～71)個(gè)月，SLE-DAI 14.8±4.7分。起病時(shí)2例合并心臟病變，2例合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，14例存在血液系統(tǒng)損害，7例存在皮膚損害，7例存在關(guān)節(jié)損害。

腎臟損害 18例患者中3例表現(xiàn)為腎病綜合征，2例表現(xiàn)為單純性鏡下血尿，13例表現(xiàn)為鏡下血尿合并蛋白尿。2例SCr升高，平均79.6±30.9 μmol/L，無患者需要行腎臟替代治療。4例有大量蛋白尿(>3.5 g/d)，沒有患者出現(xiàn)肉眼血尿。

腎臟病理類型 18例患者中Ⅲ型1例，Ⅳ型4例，Ⅳ+Ⅲ型1例，Ⅴ+Ⅳ型9例，Ⅴ+Ⅲ型3例。AI平均9.4±3.2分，CI平均2.0±1.5分。

臨床療效 采集前，回輸前，回輸后3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月、30個(gè)月的各項(xiàng)腎臟及免疫學(xué)指標(biāo)變化見表1。

表1 ASCT治療后臨床指標(biāo)的變化

續(xù)表1

ASCT：自體外周血造血干細(xì)胞移植；SLE-DAI：系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)指數(shù)；尿RBC：尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；Alb:血清白蛋白；*：與回輸前相比，P<0.05；△：與采集前相比，P<0.05

淋巴細(xì)胞亞群的變化：采集后，患者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降，回輸后出現(xiàn)上升，回輸后12個(gè)月、18個(gè)月CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)高于采集前，回輸后各時(shí)間點(diǎn)CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于采集前?；剌敽?個(gè)月CD4+T細(xì)胞比例低于采集前，3個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月、30個(gè)月CD8+T細(xì)胞比例高于采集前?；剌敽?個(gè)月、24個(gè)月、30個(gè)月CD4+/ CD8+比值顯著低于采集前(圖1)?；剌敽蠡颊逤D4+CD25+Treg計(jì)數(shù)顯著增加(圖2)。采集后，患者CD20+B細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降，回輸后快速增加(圖2)。

圖1 治療后CD4+T、CD8+T細(xì)胞的變化*：與回輸前相比，P<0.05；△：與采集前相比，P<0.05

圖2 治療后CD4+CD25+T、CD20+B細(xì)胞的變化*：與回輸前相比，P<0.05；△：與采集前相比，P<0.05

不良反應(yīng) 移植過程中，11例出現(xiàn)惡心、嘔吐(61.1%)，9例出現(xiàn)腹瀉(50%)，13例發(fā)生黏膜炎(72.2%)，9例粒缺期出現(xiàn)發(fā)熱(50%)，7例發(fā)生皮疹(38.9%)，2例發(fā)生心律失常(11.1%)，2例出現(xiàn)肝酶升高(11.1%)。沒有患者因移植導(dǎo)致死亡。

隨訪觀察 患者隨訪21(6～36)個(gè)月。在末次隨訪時(shí)，11例獲得CR(61.1%)，6例獲得PR(33.3%)，1例療效為NR(5.6%)，進(jìn)入腹膜透析。

討 論

雖然免疫抑制治療的進(jìn)步已使SLE和LN患者的預(yù)后大大改善，但是傳統(tǒng)治療方法依然存在局限。即使是多種免疫抑制劑的聯(lián)合治療，也難以完全控制患者的異常免疫狀態(tài)。此外，傳統(tǒng)免疫抑制治療對(duì)自身反應(yīng)性記憶細(xì)胞和長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞的作用有限，且不能恢復(fù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，無法恢復(fù)自身耐受。相比較而言，ASCT治療SLE和LN具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可恢復(fù)免疫耐受，實(shí)現(xiàn)疾病長(zhǎng)期緩解。

ASCT治療SLE和LN的機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為預(yù)處理時(shí)大劑量免疫抑制劑的應(yīng)用和ASCT后的免疫重建可能發(fā)揮了主要作用[10]。治療成功的關(guān)鍵在于原有的自身免疫性細(xì)胞克隆被摧毀，重建正常的免疫細(xì)胞體系[11]。ASCT后的免疫重建包括功能B細(xì)胞、胸腺及胸腺外T細(xì)胞的恢復(fù)、殺傷性T細(xì)胞與NK細(xì)胞的免疫功能重建和免疫系統(tǒng)有效抗原的表達(dá)[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，ASCT后患者臨床指標(biāo)顯著改善的同時(shí)，CD4+/CD8+比值仍持續(xù)倒置，這與傳統(tǒng)免疫抑制治療后患者的反應(yīng)完全不同。這可能是由于LN患者中淋巴細(xì)胞的凋亡機(jī)制出現(xiàn)了問題，自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞無法通過凋亡被清除，而移植后的免疫重建“校正”了對(duì)自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞失效的凋亡機(jī)制，但是“矯枉過正”。此外，治療的有效伴隨著CD4+/ CD8+的持續(xù)倒置也與大劑量化療預(yù)處理后胸腺的殘余功能有關(guān)。胸腺的作用在中年后開始退化，使CD4+T細(xì)胞在移植后需要經(jīng)過比較長(zhǎng)的時(shí)間才能逐漸恢復(fù)，與此同時(shí)CD8+T細(xì)胞卻不依賴胸腺的成熟記憶生成[13]。徐景勃等[14]的研究發(fā)現(xiàn)這種比值異常甚至在ASCT后2年仍未恢復(fù)。Farge等[15]對(duì)系統(tǒng)性硬化患者行ASCT，發(fā)現(xiàn)治療無效組的CD4+T細(xì)胞較有效組恢復(fù)快，而移植后病情平穩(wěn)時(shí)CD4+T細(xì)胞顯著減少，復(fù)發(fā)時(shí)則大幅度回升。這樣的規(guī)律可能同樣適用于ASCT后的LN患者，即CD4+/ CD8+比值的上升預(yù)示著病情的復(fù)發(fā)，但有待進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

CD4+CD25+Treg是一類具有免疫抑制效應(yīng)的CD4+T細(xì)胞亞群，約占CD4+T細(xì)胞的10%，可抑制多種效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，對(duì)于免疫穩(wěn)態(tài)的維持及對(duì)自身免疫耐受的誘導(dǎo)起重要的作用。CD4+CD25+Treg數(shù)量或功能的下降在許多自身免疫疾病中被觀察到，在這些疾病中往往還發(fā)生了針對(duì)自身抗原的以Th17細(xì)胞應(yīng)答為主的慢性炎癥[16,17]。研究發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過分泌TGF-β使CD4+CD25+Treg的數(shù)量增加[18]，這可能是其有效治療SLE的機(jī)制之一。許多患者在ASCT后雖未能完全清除自身攻擊性的免疫系統(tǒng)，但使其達(dá)到了抑制的狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)了臨床緩解。這種免疫重建的部分原因是CD4+CD25+Treg數(shù)目和活性的增加。我們研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于重型LN患者，回輸后各項(xiàng)指標(biāo)改善的同時(shí)，CD4+CD25+Treg數(shù)量顯著增加。這提示ASCT通過增加CD4+CD25+Treg的數(shù)量，抑制了Th細(xì)胞的活化，降低了B細(xì)胞激活因子的水平，最終減少自身抗體的產(chǎn)生，對(duì)包括腎臟在內(nèi)的多個(gè)器官起到保護(hù)作用。

在SLE及LN患者中，自身免疫性B細(xì)胞產(chǎn)生多種自身抗體，導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。以B細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療手段，如CD20單抗的應(yīng)用已證實(shí)有效[19]。我們研究發(fā)現(xiàn)，回輸后患者自身抗體陽性率下降，補(bǔ)體水平上升，尿蛋白等指標(biāo)獲得改善的同時(shí)，B細(xì)胞的數(shù)量卻顯著增加。我們推測(cè)，這是由于ASCT清除了患者體內(nèi)致病的B細(xì)胞克隆，而在回輸后由于并未使用大劑量的免疫抑制劑進(jìn)行維持治療，非致病的B細(xì)胞克隆迅速恢復(fù)。正是基于此，患者自身抗體轉(zhuǎn)陰的同時(shí)，正常的體液免疫迅速重建。但是需要指出的是，在回輸后6個(gè)月，患者的CD20+B細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)到比較高的水平，抗-dsDNA抗體的陽性率也上升，提示ASCT后6個(gè)月致病的B細(xì)胞克隆再次增殖，此時(shí)適量加用免疫抑制劑可能可以更好地預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。

總之，ASCT治療重型LN的療效確切，患者的腎臟及免疫學(xué)指標(biāo)可以獲得明顯改善。ASCT所導(dǎo)致的免疫重建，包括對(duì)失效的淋巴細(xì)胞凋亡機(jī)制的校正、CD4+CD25+Treg數(shù)量的增加、非致病性B細(xì)胞數(shù)量增加等機(jī)制可能發(fā)揮了重要作用，但具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯 凡 心 旅 程)

Lymphocyte subset changes in patients with lupus nephritis after autologous hematopoietic stem cell transplantation

RENGuisheng,HUANGXianghua,WANGQingwen,CHENWencui,LIUZhengzhao,ZHANGHaitao,LIUZhihong,HUWeixin

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

HUWeixin(E-mail：huwx@vip.163.com)

Objective：To observe the change of lymphocyte subsets in patients with severe lupus nephritis (LN) after the autologous hematopoietic stem cell transplantation (ASCT) and the relationship with clinical curative effect. Methodology：Eighteen patients with severe and refractory LN who underwent ASCT from June 2011 to June 2014 were investigated retrospectively, whose clinical manifestations persisted or recurred frequently after immunosuppressive therapy. Cyclophosphamide(CTX)and granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)were used before stem cell harvest, and the conditioning regimens included CTX and anti-thymocyte globulin(ATG). The therapeutic effect of ASCT on LN, as well as changes in CD4+T cells, CD8+T cells, CD4+CD25+regulatory T cells (CD4+CD25+Treg) and CD20+B cells were analyzed. Results：After ASCT, the patients’ SLE disease activity index (SLE-DAI), urine protein excretion, as well as autoantibody positive rate was decreased significantly, while the levels of serum albumin, C3 and C4 were increased notably. The counts of CD4+T cell and CD8+T cell were decreased after stem cell harvest, and then increased after transfusion. More CD4+T cells were found at 12 months、18 months after transfusion compared with before harvest, and more CD8+T cells were found every time point after transfusion compared with before harvest. The inversion of the CD4+/CD8+ratio persisted. The counts of CD4+CD25+Treg were increased notably after the treatment. The variation trend of CD20+B cells was the same as CD4+T cells and CD8+T cells. Conclusion：ASCT is an effective therapy to severe and refractory LN, but the imbalance of lymphocyte subsets persists. The increase of CD4+CD25+Treg counts may play an important role in the treatment. 6 months after transfusion, the number of CD20+B cells were increased, as well as the positive rate of autoantibodies. This suggests that it may be necessary to give immunosuppressive therapy at that time.

lupus nephritis autologous hematopoietic stem cell transplantation lymphocyte subsets

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.03.005

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2013BAI09B04,2015BAI12B05)

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)腎臟科 國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)

胡偉新(E-mail:huwx@vip.163.com)

2016-02-04

? 2016年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有