尿液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為早期糖尿病腎病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物

趙 京 王曉陽(yáng) 肖 靜 劉 棟 劉章鎖 趙占正

尿液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為早期糖尿病腎病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物

趙 京1王曉陽(yáng)2肖 靜2劉 棟2劉章鎖2趙占正2

目的：評(píng)估尿液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(uVEGF)能否作為診斷早期糖尿病腎病(DN)生物學(xué)標(biāo)志物。 方法：選擇2015年4月至10月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的2型糖尿病患者94例，分為正常白蛋白尿組(n=30)，微量白蛋白尿組(n=33)，大量白蛋白尿組 (n=31)，另選30例健康者作為對(duì)照組，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組uVEGF水平。各組患者病程、血清肌酐、尿酸、空腹血糖、糖化血紅蛋白等用Logistic回歸分析DN相關(guān)臨床指標(biāo)，ROC曲線評(píng)估靈敏度及特異性。 結(jié)果：與健康對(duì)照組uVEGF(18.44±0.73 pg/ml)相比，大量白蛋白尿組uVEGF(90.07±7.02 pg/ml，P<0.001)，微量白蛋白尿組uVEGF(75.88±9.60 pg/ml，P<0.001)和正常白蛋白尿組uVEGF(33.11±5.20 pg/ml，P=0.02)均顯著升高。uVEGF與尿白蛋白(r=0.748，P<0.001)、病程(r=0.714，P<0.001)、血清尿素氮(r=0.466，P=0.004)、估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(r=0.437，P=0.005)、血清肌酐(r=0.412，P=0.013)和總膽固醇(r=0.377，P=0.023)成顯著正相關(guān)。ROC曲線示：uVEGF早期診斷DN的cut-off值為42.573 pg/ml，敏感度為94.7%，特異度為96.4%。 結(jié)論：uVEGF可作為早期DN診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

糖尿病腎病 糖尿病 尿液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 尿白蛋白

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)的主要并發(fā)癥之一，DN發(fā)病率高達(dá)20%～40%[1-2]，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。早期診斷DN對(duì)于延緩病情進(jìn)展及臨床防治具有重要意義[3]?，F(xiàn)階段微量白蛋白尿是診斷早期DN最佳指標(biāo),但尿白蛋白不能預(yù)測(cè)DN患者是否會(huì)發(fā)生腎功能的變化[4]。因此，尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物早期診斷DN具有重要意義。

DN主要病理特點(diǎn)之一是足細(xì)胞減少[5]，足細(xì)胞可產(chǎn)生多種血管生長(zhǎng)因子，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在DN患者中升高，可能其參與DN的發(fā)生、發(fā)展[6]。本研究通過(guò)觀察不同階段T2DM患者uVEGF表達(dá)水平，評(píng)估uVEGF作為早期檢測(cè)DN生物學(xué)標(biāo)志物的可能。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年6月至10月住院治療的T2DM患者94例,其中男性48例,女性46例,平均年齡(54.7±4.34)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn) (1)T2DM診斷符合世界衛(wèi)生組織制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)臨床或腎活檢病理符合DN特點(diǎn)，持續(xù)尿白蛋白定量≥30 mg/24h和(或)估計(jì)的腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)<60 ml/(min·1.73m2)，并排除合并其他腎臟疾病的患者。

排除標(biāo)準(zhǔn) (1)DN急性并發(fā)癥、急慢性感染、發(fā)熱、心肺疾病，腎功能進(jìn)行性惡化行腎臟替代治療者，原發(fā)或繼發(fā)性肝、腎疾病和其他內(nèi)分泌代謝疾病及其他嚴(yán)重器官疾?。?2)2周內(nèi)使用過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和或血管緊張素受體拮抗劑等藥物。

根據(jù)尿白蛋白排泄量(UAER)將研究者分為3組，正常白蛋白尿組(DN1)：UAER<30 mg/24h；微量白蛋白尿組(DN2)：30 mg/24h≤UAER<300 mg/24h；DN大量白蛋白尿組(DN3)：UAER≥300 mg/24h。正常對(duì)照組(NC)：健康體檢者,無(wú)DN、高血壓、腎臟疾病和內(nèi)分泌等其他疾病。

研究方法 收集患者身高、體重，體質(zhì)量指數(shù)(BMI=體重/身高2)，血壓；記錄空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)、eGFR、糖化血紅蛋白(HbA1c)等臨床指標(biāo)，其中采用Cockcroft-Gault(C-G)公式計(jì)算eGFR；第一日晨起首次尿棄去，之后開(kāi)始留取24h全部尿液(包括次日晨起首次尿)，記錄尿總量，混勻后于自動(dòng)生物分析儀測(cè)定每100ml尿液的蛋白量，進(jìn)一步計(jì)算出24h尿總蛋白量。收集清晨中段尿10 ml，離心后取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)尿VEGF (uVEGF)水平，試劑盒由全式金生物工程有限公司提供，檢測(cè)儀器為L(zhǎng)absystem Multiskan Ascent 酶標(biāo)儀。

統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析，分類(lèi)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析uVEGF與尿蛋白及其他臨床指標(biāo)相關(guān)性，單因素Logistic回歸分析uVEGF及其他臨床指標(biāo)是否與DN發(fā)生相關(guān)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。繪制uVEGF診斷DN的ROC曲線，確定Cut-off值、靈敏度及特異度。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

一般臨床資料特征 各組年齡、性別、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DN病程、收縮壓與舒張壓有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。與CN組相比，DN1、DN2、DN3組患者TC顯著升高(P<0.001)；與DN1組比較，DN3組eGFR、BUN、SCr及HbA1c顯著升高(表1)；三組內(nèi)比較，F(xiàn)PG及TC無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

DN3組UAER、uVEGF、SCr、BUN與eGFR較DN1、DN2組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)；與DN1組相比較，DN2組eGFR、UAER和uVEGF顯著升高(P<0.01)；與CN組比較，DN1組uVEGF顯著升高(P<0.001)。

表1 各組研究對(duì)象一般臨床資料特征

DN：糖尿病腎?。籅MI：體質(zhì)量指數(shù)；FBG:空腹血糖；uVEGF：尿液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；UAER：尿白蛋白排泄量；與對(duì)照組比較*P<0.05,**：P<0.01；#：與DM1組比較，P<0.05；&：與DM2組比較，P<0.05

uVEGF與DN患者一般臨床資料相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析，uVEGF與DN病程、TG、eGFR、BUN、SCr、HbA1c及UAER顯著正相關(guān)，與年齡、BMI、SBP、FBG、及TC無(wú)相關(guān)性(表2)。

表2 uVEGF與糖尿病臨床指標(biāo)相關(guān)性

uVEGF：尿液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；BMI：體質(zhì)量指數(shù)；FBG:空腹血糖;HbA1c：糖化血紅蛋白；eGFR：估算的腎小球?yàn)V過(guò)率； UAER：尿白蛋白排泄量；SCr ：血清肌酐；BUN：血清尿素氮

單因素Logistic回歸分析 單因素Logistic回歸分析病程、FBG、TG、eGFR、BUN、SCr、uVEGF及 UAER與DN的發(fā)生相關(guān)(表3)。

表3 單因素Logistic回歸分析

BMI：體質(zhì)量指數(shù)；FBG:空腹血糖;HbA1c：糖化血紅蛋白；eGFR：估算的腎小球?yàn)V過(guò)率； UAER：尿白蛋白排泄量；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

uVEGF的ROC曲線分析 以24h尿白蛋白≥30 mg/24h為診斷DN金標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建ROC曲線評(píng)估uVEGF檢測(cè)DN的靈敏度及特異性，uVEGF診斷DN患者ROC曲線下面積為0.965，Cut-off值為42.573 pg/ml，靈敏度為94.7%，特異度為96.4%(圖1)。

圖1 尿液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的ROC曲線分析

討 論

DN是T1DM及T2DM嚴(yán)重的并發(fā)癥，最終將發(fā)展至終末期腎病[8]。因此，早期診斷及防治DN對(duì)于逆轉(zhuǎn)及延緩病情進(jìn)展尤為重要[3]。

Petrica等[9]研究發(fā)現(xiàn)，uVEGF與UAER相關(guān)，與近端小管功能障礙標(biāo)志物、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、胱抑素C、eGFR相關(guān)，DN腎功能異常者uVEGF表達(dá)明顯高于DN伴腎功能正常者。VEGF與DN病程成正相關(guān)，與T2DM患者高脂血癥及靶器官損害有一定相關(guān)性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)uVEGF與DN病程、TG、eGFR、BUN、SCr、HbA1c，特別是 UAER呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與既往研究基本一致。

目前尿微量白蛋白作為診斷早期DN金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)DN長(zhǎng)期隨訪的研究中，腎功能下降的1 132例患者中有575例(51%)患者并未出現(xiàn)白蛋白尿，因此微量白蛋白尿診斷DN特異度和敏感度仍有不足[11]；此外，傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因子并不能充分解釋疾病的風(fēng)險(xiǎn)程度，替代侵入性活檢的體液檢測(cè)，如尿液檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)DN尚未明確證實(shí)[12]。VEGF是足細(xì)胞產(chǎn)生的生物標(biāo)志物之一，主要在足細(xì)胞表達(dá)，通過(guò)旁分泌或自分泌的方式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，通過(guò)促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)血管通透性，誘發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，腎小管基膜增厚及腎間質(zhì)纖維化在DN腎臟纖維化及腎小球肥大中發(fā)揮重要作用[4]。已證實(shí)在DN的早期發(fā)展階段尿VEGF表達(dá)上調(diào)，且在T2DM伴微量蛋白尿中VEGF及其受體增加水平與尿蛋白呈平行關(guān)系[7]。同樣研究表明VEGF在DN中表達(dá)上調(diào)，甚至在DN伴正常蛋白尿時(shí)期已較正常對(duì)照組升高，說(shuō)明uVEGF比尿白蛋白出現(xiàn)的更早，且隨著DN病情進(jìn)展逐漸增多[13]。本研究以尿微量白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)確診DN，ROC曲線表明在DN正常蛋白尿時(shí)期uVEGF已顯著性升高，與既往研究一致，因此uVEGF可能作為檢測(cè)早期DN的標(biāo)志物。

早期DN患者uVEGF升高的原因目前仍未完全明確?？赡転椋?1)缺氧。研究表明缺氧狀態(tài)下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，數(shù)小時(shí)后可觀察到VEGF mRNA表達(dá)明顯增多[14]；腎小球皮質(zhì)及髓質(zhì)在急性缺氧下近曲與遠(yuǎn)曲小管可直接結(jié)合缺氧誘導(dǎo)因子1，引起VEGF mRNA顯著表達(dá)，在慢性腎臟血流減少時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞也可見(jiàn)VEGF mRNA的表達(dá)[15]。(2)高血糖。早期高糖環(huán)境激活蛋白激酶C及各種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、血管緊張素Ⅱ、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等均可上調(diào)VEGF合成及分泌[7]。AGEs可劑量依賴方式滅火NO，抑制VEGF生成，但高血糖使AGEs增多，導(dǎo)致VEGF-NO解偶聯(lián)，使得VEGF水平不受NO反饋調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致VEGF生成增多[16]。(3)足細(xì)胞損傷。DN發(fā)展早期主要表現(xiàn)足細(xì)胞數(shù)目減少，足突融合、消失，損傷的足細(xì)胞可釋放大量胞內(nèi)儲(chǔ)存的VEGF[17]。

在DN早期，uVEGF顯著增加，隨DN病情進(jìn)展逐漸增多，可作為其生物學(xué)標(biāo)記物，預(yù)測(cè)DN的病情進(jìn)展[4]。然而這些研究并未分析uVEGF預(yù)測(cè)早期DN的Cut-off值。我們的研究分析ROC曲線顯示uVEGF預(yù)測(cè)DN的Cut-off值為42.573 pg/ml，靈敏度為94.7%，特異度為96.4%，但對(duì)于這個(gè)“節(jié)點(diǎn)”的診斷效力，需要我們進(jìn)一步的大量臨床研究驗(yàn)證。

小結(jié)：在早期T2DN患者中尿VEGF水平增加，uVEGF與DN病程的進(jìn)展有顯著相關(guān)性。uVEGF可能作為診斷早期DN生物標(biāo)記物。已有研究表明VEGF在DN視網(wǎng)膜病變的作用，并將該認(rèn)識(shí)應(yīng)用于臨床治療，因此我們推測(cè)，抑制或阻斷VEGF的作用也可作為防治DN的有效措施。

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(本文編輯 律 舟 子 慕)

Urinary vascular endothelial growth factor as an early diagnostic biomarker of patients with diabetic nephropathy

ZHAOJing1,WANGXiaoyang2,XIAOJing2,LIUDong2,LIUZhangsuo2,ZHAOZhanzheng2

1InstituteofClinicalMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China2DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

ZHAOZhanzheng(E-mail：zzzdoctor@139.com)

Objective：To evaluate the levels of urinary vascular endothelial growth factor(VEGF)in type 2 diabetic patients with different degrees of diabetic nephropathy (DN) and to assess the value of vascular endothelial growth factor in the early detection of DN. Methodology：Ninty-four patients with type 2 diabetes were enrolled into this study. They were divided into three groups: normoalbuminuria (n=30), microalbuminuria (n=33), and macroalbuminuria (n=31), according to their urinary albumin excretion, and 30 healthy persons were regarded as normal controls. Urinary VEGF levels were evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay. Their clinical and laboratory data were collected. Results：The VEGF levels were significantly increased in macroalbuminuric (P<0.01)、microalbuminuric (P<0.01) and normoalbuminuric (P<0.01) diabetic patients compared to that control subjects (P<0.05). Correlation study revealed that VEGF levels were markedly positively correlated to urinary albumin (r=0.748,P<0.001), disease duration (r=0.714,P<0.001), serum urea (r=0.466,P=0.004), eGFR (r=0.437,P=0.005), serum creatinine (r= 0.412,P=0.013), and Total Cholesterol (r=0.377,P=0.023). Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis of uVEGF levels for early diagnosis and detection of DN revealed that the cut-off value of uVEGF was 42.6 pg/ml with 94.7% sensitivity and 96.4% specificity. Conclusion：The findings of the present study suggest that VEGF may be considered as a novel potential diagnostic biomarker for the early detection of diabetic nephropathy.

Diabetic Nephropathy Diabetes mellitus urinary VEGF Urinary Albumin

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.03.004

1河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室(鄭州，450052)；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科

趙占正(E-mail：zzzdoctor@139.com)

2015-11-16

? 2016年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有