中溫α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)及其發(fā)酵條件優(yōu)化

張士彬，陳景奇，崔艷艷, 謝能中，王敏，張大偉*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308) 3(廣西科學(xué)院，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧，530007)

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中溫α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)及其發(fā)酵條件優(yōu)化

張士彬1,2，陳景奇2，崔艷艷1, 謝能中3，王敏1，張大偉2*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308) 3(廣西科學(xué)院，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧，530007)

摘要以枯草芽孢桿菌為表達(dá)系統(tǒng)，以中溫α-淀粉酶為目標(biāo)蛋白，研究了啟動(dòng)子和信號(hào)肽對(duì)外源蛋白表達(dá)分泌的影響。分別選取了4種啟動(dòng)子以及8種信號(hào)肽來(lái)進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，啟動(dòng)子PAprE的強(qiáng)度最高，信號(hào)肽SPnprE的分泌效率最好。針對(duì)重組菌株1A751Q31進(jìn)行系統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化，在72 h發(fā)酵液中α-淀粉酶酶活達(dá)到380 U/mL。在7.5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液中α-淀粉酶酶活最高達(dá)到853 U/mL。以上研究表明，α-淀粉酶適合在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)表明枯草芽孢桿菌是良好的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞枯草芽孢桿菌；α-淀粉酶；啟動(dòng)子；信號(hào)肽；發(fā)酵優(yōu)化

芽孢桿菌屬中的革蘭氏陽(yáng)性菌作為生產(chǎn)和分泌蛋白的微生物，在工業(yè)領(lǐng)域已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[1]。芽孢桿菌屬作為工業(yè)微生物，擁有實(shí)用廉價(jià)的大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)，其目標(biāo)蛋白分泌量在培養(yǎng)基中可以達(dá)到20～25 g/L。目前市場(chǎng)上可以購(gòu)買(mǎi)到的酶制品大約有60%是由芽孢桿菌屬生產(chǎn)的[2-3]。在芽孢桿菌屬中，枯草芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于異源蛋白的表達(dá)。與大腸桿菌相比較，枯草芽孢桿菌被稱(chēng)為安全無(wú)害(GRAS)的表達(dá)系統(tǒng)[4]。在枯草芽孢桿菌中，盡管同源蛋白的生產(chǎn)已經(jīng)取得了較高的生產(chǎn)水平，某些同源蛋白的分泌量可以達(dá)到g/L的級(jí)別[5]，但是異源蛋白的生產(chǎn)卻通常不令人滿(mǎn)意。而且在應(yīng)用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，仍然存在一些瓶頸限制其表達(dá)分泌：如轉(zhuǎn)錄、蛋白折疊、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)肽加工、蛋白酶水解等等[6]。而其中轉(zhuǎn)錄與膜轉(zhuǎn)運(yùn)是兩個(gè)最為主要的限制因素。因此在應(yīng)用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)分泌外源蛋白時(shí)，必須要解決這兩方面瓶頸，從而獲得目標(biāo)蛋白的高水平表達(dá)分泌。

在多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，酶制劑已經(jīng)替代了以前使用的化學(xué)方法來(lái)進(jìn)行底物水解，從而在工業(yè)流程中大大降低了環(huán)境污染，同時(shí)也使得加工過(guò)程更加方便。眾所周知，α-淀粉酶能夠促進(jìn)淀粉以及α-葡聚糖中的α-1,4-糖苷鍵的水解[7]。作為糖基水解酶GH-13家族中的一員[8]，其水解產(chǎn)物為糊精、低聚糖和單糖。由于α-淀粉酶在食品、醫(yī)藥、化學(xué)制品等領(lǐng)域[7]都有廣泛應(yīng)用，如淀粉液化、焙烤行業(yè)、洗滌工業(yè)、紡織品退漿、造紙工業(yè)和燃料乙醇等等，因此市場(chǎng)對(duì)其有很大的需求，約占據(jù)酶制劑25%[9]的市場(chǎng)份額。

在本研究中，以α-淀粉酶為目標(biāo)蛋白，運(yùn)用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分泌表達(dá)。通過(guò)對(duì)表達(dá)元件的優(yōu)化，包括啟動(dòng)子和信號(hào)肽的選擇與優(yōu)化，突破或減弱枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)異源蛋白的限制，以實(shí)現(xiàn)α-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)。后續(xù)工作中，又對(duì)產(chǎn)α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌工程菌株進(jìn)行系統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化，并在7.5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。這些研究工作對(duì)中溫α-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)有一定的幫助作用，同時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌表達(dá)異源蛋白也提供了一些參考意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

文中所用菌株與質(zhì)粒均列于表1中,所用引物均列于表2中。

表1　菌株與質(zhì)粒

注：aAmerican Type Culture Collection；bBGSC,BacillusGenetic Stock Center。

1.1.2酶和試劑

dNTP和DNA聚合酶Q5購(gòu)自MBI Fermentas，DNA聚合酶PrimerSTAR Mix購(gòu)自Takara，2×TaqPCR MasterMix, DNA Marker (Marker Ⅲ和1 kb Marker )和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-02)購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒(D6943-02)和柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(D6492-02)購(gòu)自O(shè)MEGA，其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.1.3培養(yǎng)基

LB(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，Nacl 10。121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中另加入瓊脂粉15。

SR(g/L)：酵母粉25，蛋白胨15，K2HPO43。pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉20，酵母粉25，蛋白胨15，K2HPO43。121 ℃滅菌30 min。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉50，酵母粉50。121 ℃滅菌30 min。

可根據(jù)需要，在各培養(yǎng)基中分別添加相應(yīng)抗生素：氨芐青霉素100 μg/mL；卡那霉素50 μg/mL。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)條件

大腸桿菌以L(fǎng)B培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌以SR培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵。大腸桿菌以及枯草芽孢桿菌培養(yǎng)溫度均為37 ℃。搖瓶發(fā)酵時(shí)，采用250 mL三角瓶，裝液量為30 mL，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。

1.2.2α-淀粉酶基因的克隆以及包含不同啟動(dòng)子及信號(hào)肽的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)所用引物均列于表2中。α-淀粉酶基因以純化過(guò)的解淀粉芽孢桿菌ATCC23844基因組為模板通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增獲取。本實(shí)驗(yàn)中所用質(zhì)粒載體均運(yùn)用“Simple cloning”方法構(gòu)建[10]。4個(gè)啟動(dòng)子(PHpaⅡ，PApre，PsacB和Pglv)以及8個(gè)信號(hào)肽(SPAmyQ，SPsacB，SPamyE，SPnprE，SPpel，SPphoA，SPlipA和SPphoD)被用來(lái)構(gòu)建不同重組載體，具體流程如圖1。下面以pMAQ1的構(gòu)建為例進(jìn)行說(shuō)明。

表2　引物

續(xù)表2

底物序列(5’-3’)PPglv-RCGTTTTTGAATCATCATATGTAAATCCTC-CTTGATAACGTTTACAATTCPMA5-F3GTAAATGGCACGCTGATGCAGPMA5-R3CATATGTCTTTACCCTCTCCPnprE-FGGAGAGGGTAAAGACATATGCATAT-GGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGPnprE-RAAAATACTGCATCAGCGTGCCATTTA-CAGCCTGAACACCTGGCAGGCPaprE-FGGAGAGGGTAAAGACATATGAGAAG-CAAAAAATTGTGGATCAGCPaprE-RGCATCAGCGTCCCATTAAGATTTGCAGC-CTGCACAGACATGTTGCTGAACPlipA-FGGAGAGGGTAAAGACATATGAAATTTGTAAAAAGAAG-GATCATTGPlipA-RAATACTGCATCAGCGTGCCATTTACAGCG-GCTTTTGCTGACGGCTGCAACPpel-FGGAGAGGGTAAAGACATATGAAAAAAGTGATGTTAGCPpel-RCTGCATCAGCGTGCCATTTACTGCGT-TCGCGCCAGCTGGAGPamyE-FGGAGAGGGTAAAGACATATGTTTG-CAAAACGATTCAAAACCPamyE-RAATACTGCATCAGCGTGCCATTTACAG-CACTCGCAGCCGCCGGTCCTGCCPsacB-FGGAGAGGGTAAAGACATATGAACAT-CAAAAAGTTTGCAAAACPsacB-RCTGCATCAGCGTGCCATTTACCG-CAAACGCTTGAGTTGCGCCTCCTGCCPphoA-FGGAGAGGGTAAAGACATATGAAAAAAAT-GAGTTTGTTTCPphoA-RCTGCATCAGCGTGCCATTTACAGCTCCG-GCAAAGATTCCAGCTGTAAGGPphoD-FGGAGAGGGTAAAGACATATGGCATACGACAGTCGTTTTGPphoD-RCTGCATCAGCGTGCCATTTACAGCATT-TACTTCAAAGGCCCCAACCG

圖1　重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1　Construction of expression vector pMAQ

運(yùn)用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取解淀粉芽孢桿菌基因組，并以其為模板，以PAmyQ-F和PAmyQ-R為引物，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出攜帶自身信號(hào)肽(SPAmyQ)的完整amyQ基因。以PMA5-F1和PMA5-R1為引物，以質(zhì)粒pMA5為模板，擴(kuò)增出pMAQ1的載體骨架。擴(kuò)增出的兩段線(xiàn)性DNA片段的5＇端和3＇端都包含20～50 bp的重疊末端。以這些片段為模板，運(yùn)用POE-PCR (prolonged overlap extension PCR)技術(shù)擴(kuò)增出DNA多聚體，并把產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒pMAQ1。其余攜帶不同啟動(dòng)子與信號(hào)肽的重組質(zhì)粒均以此方式構(gòu)建。

1.2.3產(chǎn)α-淀粉酶重組枯草芽孢桿菌工程菌株的構(gòu)建

將1.2.2中的重組質(zhì)粒運(yùn)用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主枯草芽孢桿菌1A751感受態(tài)細(xì)胞[11]，經(jīng)過(guò)卡那霉素抗性篩選出陽(yáng)性克隆，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

1.2.4搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

(1)碳源優(yōu)化。分別以可溶性淀粉、豆餅粉、豆粕粉、麩皮、玉米漿干粉、葡萄糖、蔗糖、木糖、麥芽糖和乳糖為碳源(20 g/L的添加量)，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，SR培養(yǎng)基為對(duì)照。

(2)氮源優(yōu)化。分別選取豆餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二銨、硫酸銨和氯化銨為氮源(20 g/L的添加量)，以淀粉為碳源，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

(3)不同金屬離子及添加劑對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。分別在培養(yǎng)基中添加2 g/L的ZnSO4、FeCl3、MgSO4、CaCl2、MnSO4、NaCl、FeSO4、Tween-20和Tween-80，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

(4)發(fā)酵溫度優(yōu)化。工程菌株分別在30 ℃、37 ℃、42 ℃和45 ℃條件下，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

(5)初始pH值優(yōu)化。分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為7.0、7.5、8.0和8.5，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

1.2.57.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵評(píng)價(jià)

發(fā)酵采用總體積7.5 L發(fā)酵罐(BioFlo 310，New Brunswick Scientific CoInc., USA)，工作體積為3.5 L。發(fā)酵過(guò)程中，溫度維持37℃，pH值維持在7.0～7.5(pH值通過(guò)滴加體積分?jǐn)?shù)為40% 的H3PO4或者溶液濃度為5 mol/L的 KOH來(lái)維持)，并且通過(guò)對(duì)通風(fēng)量與攪拌速率的控制使溶氧(DO)維持在20% ～ 40%的范圍。初始培養(yǎng)基為發(fā)酵罐培養(yǎng)基(1.1.3)，另加入50 μg/mL的卡那霉素。發(fā)酵時(shí)間18 h時(shí)，以補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料操作，直至發(fā)酵周期結(jié)束(72 h)。

1.2.6酶活測(cè)定

酶活測(cè)定方法參照國(guó)標(biāo)法(GB8275—2009)。1 mL液體酶，于60 ℃，pH 6.0條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.2.7重組蛋白的SDS-PAGE分析

取不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液，離心(12 000×g，10 min，4 ℃)，取上清，加入5×SDS-PAGE樣品緩沖液后在沸水中煮15 min，樣品進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5% )。電泳結(jié)束后凝膠染色2 h，將脫色后的凝膠用 Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)照相 。

2結(jié)果與討論

2.1不同啟動(dòng)子的篩選

啟動(dòng)子的強(qiáng)度直接影響異源蛋白的表達(dá)效率，因此強(qiáng)啟動(dòng)子的優(yōu)化常用于提高基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中選取枯草芽孢桿菌中常用的四種強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)提高淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中包括兩個(gè)組成型啟動(dòng)子(PHpaⅡ和PApre)以及兩個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PsacB和Pglv，誘導(dǎo)劑分別為蔗糖和麥芽糖)。包含不同啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒分別為：pMAQ1(PHpaⅡ)，pMAQ2(PsacB)，pMAQ3(PApre)和pMAQ4(Pglv)。分別將其轉(zhuǎn)化B.subtilis1A751，得到重組菌株1A751Q1，1A751Q2，1A751Q3和1A751Q4。包含不同啟動(dòng)子菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵72 h后，進(jìn)行酶活檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

1-菌株1A751Q3; 2-菌株1A751Q1; 3-菌株1A751Q2; 4-菌株1A751Q4圖2　包含不同啟動(dòng)子的重組菌株產(chǎn)α-淀粉酶酶活比較Fig.2　Comparison of α-amylase production in recombinant strains with different promoters.

從圖2可以看出組成型啟動(dòng)子(PHpaⅡ和PApre)表達(dá)效果強(qiáng)于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PsacB和Pglv)。并且菌株1A751Q3(PApre)酶活最高達(dá)到135 U/mL，相較于其他菌株酶活將近高出100%。表明在4種啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子PApre是最有效的啟動(dòng)子。

2.2不同信號(hào)肽的篩選

在分泌型蛋白表達(dá)分泌時(shí)，信號(hào)肽起到?jīng)Q定性作用[12]。信號(hào)肽主要包括3個(gè)區(qū)域：帶正電的N末端，稱(chēng)為堿性氨基末端；中間疏水序列，以中性氨基酸為主，是信號(hào)肽的主要功能區(qū)；較長(zhǎng)的帶負(fù)電荷的C末端，含小分子氨基酸，是信號(hào)序列切割位點(diǎn)[13-14]。其主要功能有3方面：(1)防止胞內(nèi)新合成肽鏈折疊，以維持轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)象并避免激活有損害作用的酶；(2)與其它分泌裝置成分相互作用并指導(dǎo)跨膜過(guò)程；(3)膜上前蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的決定因子?？傊?，信號(hào)肽對(duì)于整個(gè)分泌過(guò)程有重要影響。因此，為了實(shí)現(xiàn)α-淀粉酶的高效分泌，尋找合適的信號(hào)肽是十分必要的。

基于前面4種啟動(dòng)子中選出的最合適啟動(dòng)子PApre，將研究中經(jīng)常使用的信號(hào)肽(SPAmyQ，SPsacB，SPamyE，SPnprE，SPpel，SPphoA，SPlipA，SPphoD)與α-淀粉酶基因amyQ融合，以強(qiáng)啟動(dòng)子PApre來(lái)啟動(dòng)其表達(dá)。將重組質(zhì)粒pMAQ31(SPnprE)，pMAQ32(SPpel)，pMAQ33(SPphoA)，pMAQ34(SPlipA)，pMAQ35(SPamyE)，pMAQ36 (SPSacB)和pMAQ37(SPphoD)分別轉(zhuǎn)化B.subtilis1A751，得到重組菌株1A751Q31，1A751Q32，1A751Q33，1A751Q34，1A751Q35，1A751Q36和1A751Q37。將以上重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在72 h取樣并進(jìn)行酶活檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

1-菌株1A751Q31; 2-菌株1A751Q32; 3-菌株1A751Q33; 4-菌株1A751Q34; 5-菌株1A751Q35; 6-菌株1A751Q36; 7-菌株1A751Q37; 8-對(duì)照菌株1A751Q3圖3　包含不同信號(hào)肽的重組菌株產(chǎn)α-淀粉酶酶活比較Fig.3　Comparison of α-amylase production in recombinant strains with different signal peptides

從圖3可以很明顯地看出，只有菌株1A751Q31，1A751Q32和1A751Q33酶活相較于對(duì)照組有所提高。SPAmyQ，SPsacB和SPamyE均為依賴(lài)Sec分泌途徑的信號(hào)肽。依賴(lài)Tat分泌途徑的菌株1A751Q37(SPphoD)酶活最低，重組菌株1A751Q31酶活最高，達(dá)到274 U/mL。表明信號(hào)肽SPnprE為最合適的信號(hào)肽，而基于Tat途徑的信號(hào)肽并不適宜α-淀粉酶的分泌。

2.3搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1碳源優(yōu)化

對(duì)前面產(chǎn)酶最高的重組菌株1A751Q31進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。不同碳源對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響見(jiàn)圖4a。從圖中可以看出，不同碳源對(duì)α-淀粉酶的生產(chǎn)有不同影響。相較于其他碳源，以淀粉為碳源時(shí)酶活達(dá)到326 U/mL，明顯高于其他碳源。可能淀粉既作為碳源，又對(duì)α-淀粉酶的生產(chǎn)起到一定的誘導(dǎo)作用，因?yàn)榈矸凼铅?淀粉酶的作用底物。以葡萄糖、蔗糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液中幾乎沒(méi)有酶活，可能由于葡萄糖效應(yīng)抑制α-淀粉酶的表達(dá)[15]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們又對(duì)淀粉添加量進(jìn)行了優(yōu)化(圖4b)，最終得出，添加20 g/L的淀粉最為合適。

a-不同碳源對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響; b-不同濃度淀粉對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響圖4　碳源優(yōu)化Fig.4　Optimization of the carbon source

2.3.2氮源優(yōu)化

不同氮源對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響見(jiàn)圖5a。從圖中能夠看出，蛋白胨為最佳氮源，菌株發(fā)酵酶活可達(dá)到380 U/mL。而使用無(wú)機(jī)氮源時(shí)菌體幾乎不再產(chǎn)酶，可能菌株在利用無(wú)機(jī)氮源時(shí)不能很好地合成蛋白,而且加入無(wú)機(jī)氮源后導(dǎo)致發(fā)酵后期發(fā)酵液pH值過(guò)高，可能會(huì)影響菌體正常生長(zhǎng)代謝。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)蛋白胨添加量進(jìn)行優(yōu)化(圖5b)，最終得出，添加20 g/L的蛋白胨最為合適。

a-不同氮源對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響; b-不同濃度蛋白胨對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響圖5　氮源優(yōu)化Fig.5　Optimization of the nitrogen source

2.3.3不金屬離子及同添加劑對(duì)產(chǎn)酶影響

不同金屬離子及添加劑對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響見(jiàn)圖6。從圖6可以看出，大部分金屬離子及添加劑對(duì)α-淀粉酶的發(fā)酵都有明顯抑制作用，可能這些離子及添加劑影響菌體的生長(zhǎng)代謝，影響到α-淀粉酶的合成和分泌，或者影響到酶分子的構(gòu)象，致使酶活性降低。

圖6　不同添加劑對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響Fig.6　Effects of different additives on the fermentation

2.3.4溫度及培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶影響

溫度及培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響分別見(jiàn)圖7a與7b。從圖7a可以看出，溫度過(guò)高和過(guò)低均不利于α-淀粉酶的生產(chǎn)。37 ℃為最佳溫度。從圖7b可以看出初始pH值為7或7.5時(shí)，酶活相差無(wú)幾。但是從pH 7.5以后，隨著pH值的升高，酶活呈明顯的下降趨勢(shì)，可能pH值過(guò)高超出了酶的最適pH值，最終致使酶損失部分活性。這表明pH值過(guò)高(尤其超過(guò)7.5)并不利于α-淀粉酶的生產(chǎn)。

a-溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響; b-初始pH值對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響圖7　溫度及培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響Fig.7　Effects of temperature and initial pH value on the results of fermentation

2.4發(fā)酵罐評(píng)價(jià)

結(jié)合搖瓶?jī)?yōu)化結(jié)果，用7.5 L發(fā)酵罐對(duì)重組菌株進(jìn)行放大發(fā)酵評(píng)價(jià)，發(fā)酵結(jié)果如圖8。從圖8a中可以看出，菌株在30 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，酶活仍持續(xù)增長(zhǎng)。在60 h時(shí)，酶活達(dá)到最大值853 U/mL，隨后酶活與生物量均有所下降，表明發(fā)酵已進(jìn)入末尾期。從發(fā)酵液上清的SDS-PAGE分析中(圖8b)也可以看出酶量的積累過(guò)程與發(fā)酵曲線(xiàn)相吻合。

M-Marker; 1-對(duì)照菌株1A751; 2-18 h; 3-24 h; 4-30 h; 5-36 h; 6-42 h; 7-48 h; 8-54 h; 9-60 h; 10-66 h; 11-72 h圖8　5 L發(fā)酵罐中重組菌株1A751Q31產(chǎn)α-淀粉酶發(fā)酵結(jié)果Fig.8　Production of α-amylase in the recombinant strain 1A751Q31 by fed-batch fermentation in a 7.5 L fermentor

3結(jié)論

強(qiáng)啟動(dòng)子的使用是提高蛋白表達(dá)量常用的策略之一?？莶菅挎邨U菌中常用的啟動(dòng)子有兩類(lèi)：組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。兩類(lèi)啟動(dòng)子各有利弊，組成型啟動(dòng)子可以使目標(biāo)蛋白持續(xù)表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白在胞內(nèi)或胞外大量表達(dá)，無(wú)需成本較貴的誘導(dǎo)劑。但同時(shí)存在目標(biāo)蛋白對(duì)菌體有害和表達(dá)可控性較差的缺點(diǎn)[16]。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具有可以控制基因轉(zhuǎn)錄開(kāi)始與停止的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可以根據(jù)具體情況需要，對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。比如，可以使細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)再開(kāi)啟目標(biāo)蛋白的表達(dá)，從而將目標(biāo)蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞帶來(lái)的傷害降到最低。因此，選擇合適的強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)于增強(qiáng)異源蛋白的表達(dá)有重要意義。

信號(hào)肽結(jié)構(gòu)是前體蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的一個(gè)限制性因素，因此為了獲得高水平的的目標(biāo)蛋白，選擇一個(gè)適合的信號(hào)肽是十分重要的。由于不同物種來(lái)源的信號(hào)肽存在一定的差異，因而在枯草芽孢桿菌中表達(dá)異源分泌蛋白時(shí)，異源分泌蛋白的天然信號(hào)肽不一定在枯草芽孢桿菌中能夠有效指導(dǎo)底物進(jìn)入蛋白質(zhì)分泌程序。也就是說(shuō)，異源分泌蛋白的天然信號(hào)肽與枯草芽孢桿菌的內(nèi)源分泌系統(tǒng)兼容性不一定好。所以，通過(guò)更換或改造異源分泌蛋白的天然信號(hào)肽能夠增加異源蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌量。

微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，而且要提供合適的發(fā)酵條件，才能使它的生產(chǎn)能力充分發(fā)揮出來(lái)。優(yōu)化發(fā)酵工藝可以充分發(fā)揮菌種的潛在能力，提高發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。因此，工藝優(yōu)化的研究尤其重要。

本文通過(guò)基因克隆將來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶基因amyQ在B.subtilis1A751中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。并通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子以及信號(hào)肽等表達(dá)元件的優(yōu)化，從4種強(qiáng)啟動(dòng)子(PHpaⅡ，PApre，PsacB和Pglv)及8種信號(hào)肽(SPAmyQ，SPsacB，SPamyE，SPnprE，SPpel，SPphoA，SPlipA和SPphoD)中分別篩選出最適宜枯草芽孢桿菌表達(dá)分泌α-淀粉酶的啟動(dòng)子PApre以及信號(hào)肽SPnprE。通過(guò)對(duì)重組菌株發(fā)酵條件的初步優(yōu)化，最終使發(fā)酵液中α-淀粉酶酶活達(dá)到380 U/mL。經(jīng)7.5 L發(fā)酵罐放大，在60 h時(shí)，發(fā)酵液中酶活達(dá)到峰值853 U/mL。本研究對(duì)于α-淀粉酶生產(chǎn)有一定借鑒作用，同時(shí)可以對(duì)運(yùn)用枯草芽孢桿菌表達(dá)異源蛋白提供指導(dǎo)。

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High level expression of medium α-amylase inBacillussubtilisand optimization of fermentation conditions

ZHANG Shi-bin1, CHEN Jing-qi2,CUI Yan-yan1, XIE Neng-zhong3, WANG Min1, ZHANG Da-wei2*

1(College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) 2(Tianjin Institute of Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China) 3(Guangxi Academy of Sciences, State Key Laboratory of Non-Food Biomass and Enzyme Technology,National Engineering Research Center For Non-food Biorefinery, Nanning 530007, China)

ABSTRACTIn this study, the effect of promoter and signal peptide on the expression of heterologous model protein, α-amylase, was studied by using Bacillus subtilis as the expression system. Four promoters and eight signal peptides were compared, and the best promoter and signal peptide for the expression and secretion of α-amylase were identified. The results indicated that PAprEand SPnprEwere the most suitable for the production of α-amylase in B.subtilis. The fermentation of the recombinant B. subtilis 1A751Q31 was then optimized, and the activity of α-amylase in the supernate achieved 380 U/mL. Fed-batch fermentation in a 7.5 L fermentor was carried out, and the activity of α-amylase in the supernate reached 853 U/mL. All the studies in this paper indicated that it was suitable for the expression of α-amylase using B. subtilis as the expression system, and B. subtilis was a suitable system for expression of heterologous proteins.

Key wordsBacillus subtilis; α-amylase; promoter; signal peptide; optimization of fermentation

收稿日期：2015-10-18，改回日期：2015-12-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31370089, 21446008, 31400079); 廣西省科技支撐項(xiàng)目 (14125008-2-22)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604010

第一作者：碩士研究生(張大偉研究員為通訊作者，E-mail：zhang_dw@tib.cas.cn)。