遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克液體復(fù)蘇大鼠心肌損傷的保護(hù)作用研究

林輝　劉雋華　周天恩　楊正飛

510640 廣州，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科(林輝)；510700 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)皮膚科(劉雋華)；510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院急診科(周天恩，楊正飛)

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遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克液體復(fù)蘇大鼠心肌損傷的保護(hù)作用研究

林輝劉雋華周天恩楊正飛

510640 廣州，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科(林輝)；510700 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)皮膚科(劉雋華)；510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院急診科(周天恩，楊正飛)

【摘要】目的利用心臟超聲、心電圖以及心肌損傷標(biāo)志物綜合評(píng)價(jià)遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克液體復(fù)蘇大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。方法成年健康雄性SD大鼠(300～350 g)36只，隨機(jī)分為3組(n=12)：空白對(duì)照組(C組)、失血性休克復(fù)蘇組 (SR組)和遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理組 (RIPC組)。經(jīng)股動(dòng)脈持續(xù)1 h放出全身血容量的50%血液，1 h后由股靜脈30 min回輸全部自體血，建立失血性休克和復(fù)蘇模型。RIPC組于放血前40 min采用止血帶阻斷雙側(cè)后肢血流5 min，松開5 min，反復(fù)4次，行遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理。于基礎(chǔ)狀態(tài)(BL)、放血結(jié)束即刻(S1)、回輸自體血液前(S2)、回輸結(jié)束即刻(R1)、回輸后1 h(PR1h)以及2 h(PR2h)，記錄心電圖以及平均動(dòng)脈壓(MAP)，采用心臟彩色多普勒超聲測(cè)量心輸出量、LVEF、左心室短軸縮短率(FS)以及左心室心肌活動(dòng)指數(shù)(Tei Index)，利用免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)動(dòng)脈血在BL、S2、PR2h時(shí)間點(diǎn)的心肌肌鈣蛋白I(cTnⅠ)濃度，觀察大鼠復(fù)蘇后72 h存活情況。結(jié)果與C組相比，SR組在S1至PR2h時(shí)，RIPC組在S1和S2時(shí)MAP、心輸出量、LVEF降低，Tei Index升高(P<0.01)；和SR組比較，RIPC組在復(fù)蘇開始后的MAP、心輸出量、LVEF升高，Tei Index降低(P<0.01)；在S1至PR2h，SR組與RIPC組ST段偏移程度以及cTn I濃度比C組增加(P<0.01)；然而，RIPC組的ST段偏移程度較SR組輕(P<0.01)，復(fù)蘇存活率較高(P<0.01)。結(jié)論遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理顯著減輕失血性休克液體復(fù)蘇后大鼠的心肌缺血再灌注損傷，明顯改善了生存預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】休克; 心肌缺血再灌注損傷; 缺血預(yù)處理; 心功能; 肌鈣蛋白I

心胸外科手術(shù)、選擇性血管外科手術(shù)、腫瘤切除術(shù)中均可能并發(fā)大出血，導(dǎo)致失血性休克[1]。盡管及時(shí)的液體復(fù)蘇后可以糾正血流動(dòng)力學(xué)，然而缺血再灌注引起的心肌損傷不利于預(yù)后[2-3]。許多研究證實(shí)，遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理可改善缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[4]。然而遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理減輕失血性休克液體復(fù)蘇后誘發(fā)的心肌損傷程度的研究并不多見。心臟超聲、心電圖以及心肌損傷標(biāo)志物的變化綜合反映心肌損傷的嚴(yán)重程度[5-6]。本研究擬從心臟超聲以及心電圖等方面評(píng)價(jià)遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理對(duì)失血性休克液體復(fù)蘇大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。

材料與方法

一、 動(dòng)物選擇及隨機(jī)分組

成年健康雄性10周齡的SD大鼠36只，體質(zhì)量300～350 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，普通安靜的環(huán)境[溫度(25±1)℃，濕度(50±5)%]適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表方法，把動(dòng)物分為3組：空白對(duì)照組(C組，n=12)、失血性休克復(fù)蘇組(SR組，n=12)和遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理組(RIPC組，n=12)。

二、 失血性休克復(fù)蘇動(dòng)物模型的制備

大鼠麻醉前禁食12 h，自由飲水。利用二氧化碳誘導(dǎo)麻醉后，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，仰臥位固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。取頸正中切口，置入右頸靜脈插管用于輸血及監(jiān)測(cè)中心靜脈壓；分離右側(cè)股動(dòng)脈以及股靜脈并置入導(dǎo)管用于放血及監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)。經(jīng)股靜脈注射肝素200 U/kg，10 min后采用抽血輸血雙向全自動(dòng)注射泵 BYZ-810D (比揚(yáng)醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)長(zhǎng)沙)經(jīng)股動(dòng)脈持續(xù)放血1 h，血液收集在20 ml無菌注射器內(nèi)。失血量為總血容量的50%。觀察1 h后，經(jīng)30 min由股靜脈回輸全部自體血，建立失血性休克和復(fù)蘇模型。自體血回輸結(jié)束后觀察2 h，待大鼠清醒后拔除所有導(dǎo)管，縫合傷口，肌肉注射頭孢咪唑預(yù)防感染。實(shí)驗(yàn)過程中采用燈照直射維持直腸溫度(38.0±0.5)℃。等待動(dòng)物翻身反射恢復(fù)且清醒后回籠飼養(yǎng)觀察。C組不放血，手術(shù)操作同SR組。RIPC組于放血前40 min采用止血帶阻斷雙側(cè)后肢血流5 min，松開5 min，反復(fù)4次，行遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理，其余操作同SR組。阻斷血流的標(biāo)準(zhǔn)：雙后肢皮膚顏色改變，皮膚溫度下降，止血帶捆綁以下部位超聲監(jiān)測(cè)不到動(dòng)脈搏動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)方案遵循的程序經(jīng)過中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查討論后批準(zhǔn)實(shí)行。

三、 心臟彩色多普勒超聲(彩超)

于基礎(chǔ)狀態(tài)(BL)、放血結(jié)束即刻(S1)、回輸自體血液前(S2)、回輸結(jié)束即刻(R1)、回輸后1 h(PR1h)以及2 h(PR2h)，采用HD15彩色超聲儀(飛利浦公司，荷蘭)測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，計(jì)算心輸出量、LVEF以及左心室短軸縮短率(FS)，F(xiàn)S=(LVEDD-LVESD)/ LVEDD×100%；測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期等容舒張時(shí)間(IVRT)、等容收縮時(shí)間(IVCT)和射血時(shí)間(ET)，計(jì)算左心室心肌活動(dòng)指數(shù)(Tei Index)，Tei Index=(IVCT+IVRT)/ET。

四、 心電圖ST變化

采用邁瑞B(yǎng)eneViewT5監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)心電圖和MAP，并利用Windaq生理記錄儀連續(xù)記錄大鼠的心電圖、MAP等生理參數(shù)。以BL的ST段為基線標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算S1，S2，R1，PR1h以及PR2h的ST變化值。

五、 心肌損傷標(biāo)志物

在BL，S2，PR2h時(shí)間點(diǎn)分別抽取動(dòng)脈血0.5 ml，低溫離心后提取上清液，利用ACCESS 2免疫化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I(cTnⅠ)濃度。

六、 生存結(jié)局

記錄大鼠失血性休克復(fù)蘇后72 h的生存結(jié)局情況(每組存活率=每組存活大鼠數(shù)量/每組實(shí)驗(yàn)大鼠總數(shù))。

七、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、3組大鼠各個(gè)時(shí)刻血流動(dòng)力學(xué)以及心功能指標(biāo)的比較

在BL時(shí)刻3組大鼠的生理學(xué)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照大鼠C組比較，在S1，S2，R1時(shí)刻SR組與RIPC組MAP明顯下降；在S1至PR2h時(shí)刻，SR組與RIPC組大鼠的心輸出量、LVEF降低，Tei Index升高(P<0.01)；而FS在S1至R1時(shí)明顯升高，在回輸血液復(fù)蘇后逐漸下降(P<0.01)。與SR組大鼠比較，RIPC組在S1至PR2h時(shí)，MAP、心輸出量和LVEF，F(xiàn)S升高，Tei Index降低(P<0.01)，見表1。

表1

3組大鼠各個(gè)時(shí)刻血流動(dòng)力學(xué)以及心功能指標(biāo)的比較±s)

注：與C組比較，aP<0.01，與SR組比較，bP<0.01，與前一時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05/5；1 mm Hg=0.133 kPa

二、3組大鼠各個(gè)時(shí)刻心電圖ST段變化的比較

與對(duì)照大鼠C組比較，在S1至PR2h時(shí)SR組與RIPC組ST段較BL明顯偏移(P<0.01)。在S1和S2時(shí)，SR組與RIPC組大鼠的ST段明顯下移；在R1至PR2h時(shí)，SR組與RIPC組大鼠的ST段明顯上抬； 然而，對(duì)比RIPC組大鼠，SR組偏移程度顯著增大(P<0.01)，見表2。

表2

3組大鼠各個(gè)時(shí)刻心電圖ST段變化的比較±s)

注：與C組比較，aP<0.01;與SR組比較，bP<0.01;與前一時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05/5

三、3組大鼠cTn I濃度的變化結(jié)果

C組大鼠的cTn I濃度在BL、S2、PR2h時(shí)間點(diǎn)變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SR組以及RIPC組大鼠的cTn I濃度在S2、PR2h明顯高于BL(P<0.01)。然而，cTn I濃度在RIPC組在S2、PR2h低于SR組(P<0.01)，見圖1。

圖1　三組動(dòng)物不同時(shí)間cTnⅠ濃度變化的比較

注：與C組比較，*P<0.01；與SR組比較，#P<0.01；與前一時(shí)間點(diǎn)比較，+P<0.05/2

四、72 h生存結(jié)局

SR組和RIPC組動(dòng)物液體復(fù)蘇后72 h內(nèi)存活率分別為2/12和10/12，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討論

失血性休克進(jìn)行液體復(fù)蘇后引起的缺血再灌注心肌損傷嚴(yán)重程度與出血量和休克時(shí)間密切相關(guān)[7]。根據(jù)既往的研究，利用出血量為總血容量50%，休克時(shí)間為1 h的方法制備嚴(yán)重的失血性休克模型，并在休克后回輸自體血進(jìn)行復(fù)蘇[8]。而在本實(shí)驗(yàn)中，休克時(shí)間延長(zhǎng)至2 h。結(jié)果表明，動(dòng)物放血后MAP明顯降低至60 mm Hg以下，提示大鼠失血性休克模型制備成功；回輸自體血后MAP回升至60 mm Hg，提示復(fù)蘇成功。

既往研究表明，遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理可以有效保護(hù)離體心肌的缺血再灌注損傷，包括改善心肌最大收縮速率，減少心肌的凋亡。參考既往實(shí)驗(yàn)，我們?cè)谘芯恐欣梅叛?0 min采用止血帶阻斷雙側(cè)后肢血流5 min，松開5 min，反復(fù)4次的方法進(jìn)行肢體缺血預(yù)處理。我們的結(jié)果和既往研究一致表明，遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理有效保護(hù)了失血性休克液體復(fù)蘇后動(dòng)物的心功能，提高了復(fù)蘇后的心輸出量以及射血分?jǐn)?shù)，并改善了Tei Index以及FS，從而改善了生存預(yù)后[5]。

心肌缺血再灌注時(shí)，心肌中的氧張力降低或無氧代謝會(huì)加強(qiáng)，出現(xiàn)了電位差，即可出現(xiàn)ST段的偏移。在本研究中，大鼠經(jīng)歷失血性休克后的缺血損傷以后，心電圖首先是在缺血階段出現(xiàn)ST段下移；在液體復(fù)蘇再灌注后，出現(xiàn)明顯的心肌損傷，ST段繼而上抬。缺血預(yù)處理后，休克后復(fù)蘇大鼠的心電圖ST段在缺血階段以及再灌注后ST段的偏移明顯減少。這些結(jié)果表明，預(yù)處理改善了缺血再灌注的心肌損傷。

cTnⅠ被認(rèn)為是臨床上診斷心肌損傷和壞死特異性最強(qiáng)、敏感度最高的“ 金指標(biāo)”，當(dāng)心肌細(xì)胞通透性增加時(shí)，cTnⅠ即會(huì)從心肌細(xì)胞中滲出到血液中，從而使血清cTnⅠ水平明顯升高。本研究顯示，缺血和再灌注損傷后，休克大鼠血清cTnⅠ明顯升高；然而，經(jīng)過缺血預(yù)處理的大鼠cTnⅠ僅輕度增高。因此，經(jīng)過遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理后，缺血再灌注引起的心肌損傷程度明顯減輕。

綜上所述，遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理可顯著減輕失血性休克液體復(fù)蘇后大鼠的心肌缺血再灌注損傷，從而明顯改善了生存預(yù)后。

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Effect of remote ischemic pre-conditioning on myocardial ischemic injury in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model

LinHui,LiuJuanhua,ZhouTianen,YangZhengfei.

DepartmentofInternalMedicine,HospitalofSouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510640,China

【Abstract】ObjectiveCardiac ultrasound, electrocardiogram and measurement of myocardial injury markers were performed to comprehensively investigate the effect of remote ischemic pre-conditioning (RIPC) upon myocardial ischemic injury in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model. MethodsThirty six male adult Sprague-Dawley rats, weighing 300-350 g, were randomly divided into the sham control (C), hemorrhagic shock-reperfusion (SR) and RIPC groups (n=12 for each group). Hemorrhagic shock-reperfusion rat models were established by 60-min bleeding (50% of total blood volume) via femoral artery followed by 30-min reperfusion via femoral vein at 1 h later. In the RIPC group, bilateral hind limbs were clamped at 40 min before hemorrhage. The procedure involved four cycles of 5 min of ischemia followed by 5 min of reperfusion. Electrocardiographic tracing and mean arterial pressure (MAP) were continuously recorded for at baseline (BL), immediately after bleeding (S1), before reperfusion (S2) and after reperfusion (R1) and 1 h after reperfusion (PR1h) and 2 h after reperfusion (PR2h, respectively. Cardiac output (CO), left ventricular ejection fraction (LVEF), fractional shortening (FS) and Tei Index were measured by electrocardiogram. The concentration of cardiac troponin I (cTnI) in the arterial blood was measured at BL, S2 and PR2h. The survival of animals was observed at 72 after resuscitation. ResultsCompared with the C group, the MAP, CO and FS in the SR group at S1-PR2h, and in the RIPC group at S1-S2 were significantly decreased whereas Tei Index was considerably elevated (all P<0.01). Compared with the SR group, the MAP, CO and FS were significantly decreased whereas Tei Index was considerably increased in the RIPC group after resuscitation (all P<0.01). From S1 to PR2h, ST-segment depression and cTn I concentration in the SR and RIPC groups were significantly higher than those in the C group (all P<0.01), whereas the degree of increase in the RIPC group was significantly less than that in the SR group (P<0.01). The survival rate after resuscitation in the RIPC group was also significantly higher compared with that in the SR group (P<0.01). ConclusionRIPC effectively alleviates myocardial ischemic injury and significantly enhances prognosis outcomes in a hemorrhagic shock-reperfusion rat model.

【Key words】Shock; Myocardial reperfusion injury; Ischemic pre-conditioning; Cardiac function; Troponin I

(收稿日期：2015-12-06)(本文編輯：楊江瑜)

Corresponding author， Yang Zhengfei, E-mail: yangzhengfei@vip.163.com

通訊作者，楊正飛，E-mail:yangzhengfei@vip.163.com

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.006

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