國(guó)內(nèi)多囊卵巢綜合征動(dòng)物模型構(gòu)建的現(xiàn)狀及評(píng)價(jià)

耿紅玲 顧春曉 徐 珉 陳 頤

(廣東省中醫(yī)院婦科,廣州,510120)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是一種常見的婦科生殖內(nèi)分泌異常疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,但確切病因病理尚不明確。針對(duì)PCOS動(dòng)物的造模多種多樣,我們檢索了相關(guān)文獻(xiàn),將文獻(xiàn)中對(duì)PCOS造模選用的動(dòng)物品系、造模藥物、時(shí)長(zhǎng),模型評(píng)價(jià)等方面進(jìn)行分析,以期對(duì)PCOS造模有所幫助。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)來源 中國(guó)知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(kù)(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(China Science Periodical Database,CSPD)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(Chinese Citation Database,CCD)。

1.2 檢索策略 檢索2017年1月1日至2021年3月10日CNKI、CSPD、CCD數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)于PCOS模型的相關(guān)文獻(xiàn)。發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)暫未采用猴、豬、兔、羊動(dòng)物構(gòu)建PCOS模型,1篇采用斑馬魚構(gòu)建PCOS模型[1],更多采用的是嚙齒類動(dòng)物。CNKI、CSPD采用題目或關(guān)鍵詞:多囊卵巢綜合征或PCOS合并摘要鼠。CCD采用題目/關(guān)鍵詞:多囊卵巢綜合征或PCOS合并任意字段鼠。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) PCOS基礎(chǔ)研究,并且文中具體提到PCOS模型構(gòu)建的方法。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 臨床類、綜述類、會(huì)議論文、比較不同動(dòng)物模型的文獻(xiàn)。

1.5 數(shù)據(jù)的規(guī)范與數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

1.5.1 數(shù)據(jù)的規(guī)范 由2位研究者檢索文獻(xiàn)并核實(shí)最終獲取文獻(xiàn),對(duì)來源同一課題組或同一作者(但研究方法一樣)的不同文獻(xiàn)視為一篇。2位研究者錄入數(shù)據(jù)并保證真實(shí)準(zhǔn)確。

1.5.2 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 建立Excel表格,分為品系、周齡,造模藥物,時(shí)長(zhǎng),高脂飲食,造模評(píng)價(jià)條目,分析文獻(xiàn)后逐條填入。

1.6 數(shù)據(jù)分析 共獲取文獻(xiàn)中選用的動(dòng)物品系、鼠齡、造模藥物、造模時(shí)長(zhǎng)、有無高脂飲食,造模評(píng)價(jià)等條目進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物品系和鼠齡選擇 品系:以大鼠使用最多,占比91.0%,小鼠占比9%。鼠齡:大鼠鼠齡多選用21～24日齡,占比44.2%,其次是大于24日齡小于60日齡,占比38.9%。在小鼠的文獻(xiàn)研究中,鼠齡選用最多的是21～30 d,占比82.3%。見表1。

表1 品系分布及鼠齡文獻(xiàn)數(shù)量

2.2 造模的方法

2.2.1 藥物選擇 目前文獻(xiàn)中嚙齒類PCOS動(dòng)物模型通常采用雄激素、芳香酶抑制劑、人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotrophin,hCG)+胰島素、雌激素、抗孕激素以及改變光照等手段構(gòu)建PCOS模型,其中造模方法采用最多的是雄激素造模,占比55.6%,其次是來曲唑造模,占比33.3%。見表2。

表2 造模藥物

2.2.2 造模時(shí)長(zhǎng) 各種造模方法中造模時(shí)長(zhǎng)最多的20～30 d,占比79.4%。見表3。

表3 造模時(shí)長(zhǎng)

2.3 是否添加高脂高糖飲食 文獻(xiàn)中26.5%造模過程中聯(lián)合高脂高糖飼料喂食。

2.4 模型評(píng)價(jià) 文獻(xiàn)中造模后未對(duì)模型是否成功進(jìn)行評(píng)價(jià)的占比31.2%,對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)的占比68.8%。所采用的模型評(píng)價(jià)方法中:單純選用陰道涂片方法的占比31.7%,其次是陰道涂片聯(lián)合血清學(xué)的方法,占比12.2%。見表4。

表4 模型評(píng)價(jià)

2.5 中醫(yī)證型的選擇 文獻(xiàn)中專門針對(duì)中醫(yī)證型建立PCOS模型,分別為腎陰虛[2]、腎陽虛[3]及痰濕型[4]。

3 討論

3.1 動(dòng)物選擇 大鼠因?qū)π约に孛舾?有較穩(wěn)定的動(dòng)情周期,而且對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究又經(jīng)濟(jì)方便,因此是研究PCOS的首選動(dòng)物。大鼠8周齡時(shí)性成熟,哺乳期為21 d。小鼠35～50日齡性成熟,哺乳期21 d。文獻(xiàn)中最多選用的是剛脫離哺乳期的鼠,其次是選用哺乳期后至性成熟期前的鼠,根據(jù)大鼠年齡與相當(dāng)于人的年齡的換算,1～8周齡的大鼠相當(dāng)于人的年齡的8歲,表明絕大多數(shù)文獻(xiàn)選用的動(dòng)物在青春前期或青春期,并非處于性成熟期的育齡期。根據(jù)“青春期發(fā)育亢進(jìn)學(xué)說”,假性性早熟已被確定為兒童日后發(fā)展成PCOS的危險(xiǎn)因素之一,故剛離乳幼年雌性大鼠最為常用[5]。未斷乳的鼠在飼養(yǎng)及造模過程中容易死亡,故采用較少。1篇選用20周動(dòng)物造模與其研究氧化損傷及組織退行性變化的亞急性衰老有關(guān)[6]。對(duì)年幼階段動(dòng)物的研究是否也適用育齡女性的PCOS的認(rèn)識(shí),不同年齡段的PCOS動(dòng)物模型是否存在差異,對(duì)于從來沒有規(guī)律的性周期與既往有過規(guī)律的性周期的動(dòng)物造模,有無區(qū)別,值得進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 造模方法 采用最多的是雄激素及來曲唑構(gòu)建模型。雄激素造模原理:脫氫表雄酮硫酸酯的原料藥不溶于水,硫酸普拉睪酮鈉是脫氫表雄酮硫酸酯的硫酸鈉鹽制劑。因脫氫表雄酮硫酸酯為油劑,不易吸收,在造模時(shí)可采用溶液酒精燈加熱溶解均勻后,并輕輕揉按注射部位促進(jìn)吸收[7]。注射脫氫表雄酮硫酸酯是外源性途徑提高脫氫表雄酮硫酸酯水平,造成雄烯二酮水平增高,進(jìn)而睪酮及雌酮水平升高,造成PCOS高雄激素血癥。升高的雌酮水平對(duì)促卵泡素負(fù)反饋使促卵泡素相對(duì)不足,從而導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙及卵巢多囊改變。長(zhǎng)期暴露于DHT、丙酸睪酮可導(dǎo)致大鼠排卵功能障礙。但是人PCOS與通過外源注射雄激素所建立起來的動(dòng)物模型在對(duì)治療的反應(yīng)、形態(tài)及激素改變等許多方面都有很大差別,故停用脫氫表雄酮硫酸酯后恢復(fù)排卵的周期仍有待進(jìn)-步商榷[8]。

來曲唑造模原理:來曲唑?yàn)榉枷忝敢种苿?通過抑制雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的限速酶——芳香化酶的活性,導(dǎo)致體內(nèi)雄激素的增加,形成高雄激素血癥,進(jìn)而發(fā)展為多囊卵巢。來曲唑誘導(dǎo)動(dòng)物模型表現(xiàn)為PCOS生殖和代謝兩方面癥狀,但停止來曲唑誘導(dǎo)后,小鼠生殖功能恢復(fù)。同時(shí),該模型不適合研究雌激素高的多囊卵巢綜合征[9]。

hCG+胰島素法造模原理:胰島素能刺激卵巢卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞合成雄激素,降低血中性激素結(jié)合蛋白,使雄激素濃度增加。hCG發(fā)揮類促黃體素的作用,在卵泡早期使用,可導(dǎo)致卵泡閉鎖。該模型卵巢呈多囊化、無排卵,大鼠體內(nèi)持續(xù)促黃體素樣作用,出現(xiàn)高胰島素血癥和高雄激素血癥。雖然該模型的研究數(shù)量不如雄激素模型那么多,但該模型呈典型PCOS特征與臨床癥狀高度相似[9],并認(rèn)為胰島素(Insulin,INS)+hCG法誘導(dǎo)的大鼠模型其生殖及代謝指標(biāo)的變化較來曲唑更具優(yōu)勢(shì)[10]。

孕激素+hCG法原理:皮下埋避孕棒,可抑制下丘腦-垂體-卵巢(Hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO)軸,使性激素分泌呈低水平,導(dǎo)致不排卵。此種造模方法時(shí)間較短。1篇左炔諾孕酮硅膠棒聯(lián)合hCG,造模時(shí)間10 d[11]。1篇皮下埋植左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒(75 mg),3 d后2次皮下注射1.5 IU/0.2 mL hCG,共注射9 d[12]。此種模型卵巢與PCOS患者病理形態(tài)學(xué)和血漿激素水平相似。但該模型對(duì)HPO軸相關(guān)的PCOS的病因分析具有局限性[9]。

米非司酮造模原理:抗孕激素米非司酮作為一種強(qiáng)效的抗孕激素藥物,具有較強(qiáng)的抑制排卵作用。使用抗孕激素米非司酮造模后卵巢持續(xù)不排卵與血清促黃體素升高的同時(shí)作用促進(jìn)卵巢多囊樣改變的形成;同時(shí)高水平的促黃體素能夠促進(jìn)抑制素水平的升高,從而導(dǎo)致促卵泡素下降,促黃體素高表達(dá)能促進(jìn)雄激素的合成,表現(xiàn)為睪酮水平明顯升高,促使卵泡閉鎖,具有PCOS的不排卵,雄激素增高的典型特征[13]。該種方法造模時(shí)間不長(zhǎng),文獻(xiàn)[14-15]分別為9 d、14 d。

雌激素造模原理:長(zhǎng)期雌激素刺激可致下丘腦神經(jīng)元退化,垂體出現(xiàn)代償性增生,并對(duì)促性腺激素釋放激素刺激出現(xiàn)異常反應(yīng),導(dǎo)致促黃體素顯著升高,同時(shí)促卵泡素也會(huì)升高。雖然戊酸雌二醇誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物PCOS模型中卵巢的生理學(xué)和解剖學(xué)與人類相似,但未見人類典型代謝異常數(shù)據(jù),該模型不適合下丘腦-卵巢軸相關(guān)研究。此外,雌激素模型的性激素特征和卵巢形態(tài)特征也不一致[9]。

光照造模原理:嚙齒動(dòng)物發(fā)情周期與晝夜系統(tǒng)相關(guān),光暗周期可以控制動(dòng)物促性腺激素和排卵情況。持續(xù)光照在無激素條件下可誘導(dǎo)PCOS模型,但該模型轉(zhuǎn)至正常光照周期環(huán)境,PCOS特征可恢復(fù)正常[9]。因此,需要進(jìn)一步評(píng)估該模型在PCOS病因和發(fā)病機(jī)制與PCOS患者的相似性。

其他還有單純高糖高脂飲食構(gòu)建PCOS模型,該造模方法并非由外源激素誘導(dǎo)或通過改變類固醇生成途徑誘導(dǎo),高脂高糖飲食可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)高胰島素血癥,胰島素水平升高可導(dǎo)致卵巢卵泡膜細(xì)胞的雄激素產(chǎn)生增加。雄激素水平升高與無排卵有關(guān),并加速大鼠卵泡閉鎖,從而導(dǎo)致生殖健康受損及代謝紊亂[16]。亦提示高脂高糖飲食為PCOS潛在病因,但此種造模時(shí)間較長(zhǎng),造模時(shí)間為14周以上。

針對(duì)造模時(shí)長(zhǎng)張萍等[17]研究發(fā)現(xiàn)脫氫表雄酮硫酸酯誘導(dǎo)20 d的PCOS大鼠模型,經(jīng)歷4周后,不存在自愈,與持續(xù)造模相比更為簡(jiǎn)便易行,同時(shí)其卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)以及激素水平變化也更符合臨床表現(xiàn),但此模型因其藥物未被完全吸收,如研究激素水平,需要預(yù)留一定時(shí)間使其吸收。另一項(xiàng)模型研究表明來曲唑聯(lián)合高脂膳食連續(xù)喂養(yǎng)27 d,可成功復(fù)制符合PCOS胰島素抵抗患者病理特征及內(nèi)分泌、代謝紊亂的大鼠模型[18]。對(duì)于多長(zhǎng)時(shí)間可以造模成功,可能與造模藥物種類及方法有關(guān)。

雖然PCOS造模方法多種,但沒有哪一種可以比較全面反映PCOS的特征,也體現(xiàn)出PCOS疾病的復(fù)雜性及高度的異質(zhì)性,需要不斷探索,尋找更貼近PCOS本質(zhì)的造模方法。

3.3 是否添加高脂高糖飲食 26.5%的文獻(xiàn)提到造模過程中聯(lián)合高脂高糖飼料喂養(yǎng),考慮到PCOS是一種代謝異常的疾病,常合并糖脂代謝的異常,故在行藥物造模的同時(shí)常采用高脂高糖飼料喂養(yǎng),是否添加高脂高糖飲食與自己所研究的方向及目的相關(guān)。

3.4 模型評(píng)價(jià) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒Φ慕⑹乔疤?是進(jìn)行下一步研究的基礎(chǔ),只有動(dòng)物的造模是成功的,其研究結(jié)果才有可信性。PCOS動(dòng)物模型評(píng)價(jià)使用最多的是單純陰道涂片,此種方法簡(jiǎn)單易行,可幫助判斷動(dòng)物是否存在規(guī)律的性周期變化,是否處于無排卵狀態(tài)。如果連續(xù)2個(gè)性周期陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化現(xiàn)象,并失去規(guī)律的動(dòng)情周期則提示無排卵。其次是采用生化指標(biāo)評(píng)價(jià),此種評(píng)價(jià)方法包括檢測(cè)性激素、生化指標(biāo)等協(xié)同判斷模型的成功與否,較單純的陰道涂片更進(jìn)一步。此外是病理學(xué)指標(biāo),病理主要是觀察卵巢的鏡下改變是否符合PCOS改變,一般是隨機(jī)抽取判斷。病理學(xué)指標(biāo)是評(píng)價(jià)PCOS模型的Ⅰ類指標(biāo),可準(zhǔn)確、直接說明PCOS的病變組織形態(tài)特點(diǎn),權(quán)重系數(shù)0.4[5],光鏡下見卵巢呈多囊樣改變,白膜增厚,閉鎖卵泡數(shù)目增多,卵泡膜細(xì)胞層增厚,可見黃體和白體明顯減少。顆粒細(xì)胞層增厚,顆粒細(xì)胞層數(shù)減少,僅為數(shù)層,顆粒細(xì)胞排列致密、染色加深是PCOS典型表現(xiàn)。生化指標(biāo)是Ⅱ類指標(biāo),PCOS模型建立后性激素及胰島素抵抗指數(shù)會(huì)出現(xiàn)變化,生化指標(biāo)變化是PCOS發(fā)生、發(fā)展、康復(fù)過程的機(jī)體反映,也是模型成功與否的指征,但特異性稍低,權(quán)重系數(shù)為0.4[5]。表觀指標(biāo)是Ⅲ類指標(biāo),PCOS最直接的判定標(biāo)準(zhǔn)是表觀指標(biāo)的變化,模型建立后,可見模型動(dòng)物閉經(jīng)、體質(zhì)量明顯增加、卵巢表面蒼白,卵巢包膜增厚明顯,體積增大,重量增大。根據(jù)表觀指標(biāo)的特點(diǎn),有利于模型的判斷,但由于其特異性不強(qiáng),表觀指標(biāo)權(quán)重系數(shù)0.2[5]。模型評(píng)價(jià)盡量選用權(quán)重系數(shù)較高的指標(biāo),雖然陰道脫落細(xì)胞涂片未被列入評(píng)價(jià)指標(biāo)中,但因其方便快速,簡(jiǎn)易可行被研究者廣泛采用。同時(shí)對(duì)模型評(píng)價(jià)不應(yīng)局限于一種方法,可2種甚至3種方法聯(lián)合來判斷模型的成功與否。此外,造模后研究者時(shí)常進(jìn)行治療藥物干預(yù),在治療藥物干預(yù)期間,模型鼠是否會(huì)恢復(fù)正常狀態(tài)亦是需要考慮的問題,所以也有在治療藥物干預(yù)期間繼續(xù)進(jìn)行造模藥物的使用,防止大鼠恢復(fù)排卵[19],保證疾病模型的持續(xù)存在,但是此種情況存在造模藥物的持續(xù)使用是否對(duì)治療藥物的治療效果產(chǎn)生影響的問題。

3.5 中醫(yī)證型選擇 方證對(duì)應(yīng)是中醫(yī)辨證方法及理論的最終體現(xiàn),也是中醫(yī)藥發(fā)揮臨床療效的最終落腳點(diǎn)。所以在對(duì)中醫(yī)藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí),應(yīng)考慮與中醫(yī)藥相對(duì)應(yīng)的證型問題。在獲取的文獻(xiàn)中,有3篇專門針對(duì)中醫(yī)證型建立PCOS模型,雖然有的文獻(xiàn)提到痰濕證但其造模方法與非痰濕證模型并無明顯不同。此外亦有來曲唑聯(lián)合細(xì)菌內(nèi)毒素法建立PCOS腎虛血瘀的模型[20]。臨床中患者中醫(yī)證型不同,其PCOS的表現(xiàn)及生物學(xué)指標(biāo)不盡相同,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí),尤其是涉及到中醫(yī)藥的研究,可能考慮到病證結(jié)合才能做到與臨床更為貼近,更加符合中醫(yī)藥的辨證論治,才能更好研究辨證用藥的作用機(jī)制,才會(huì)有更強(qiáng)的說服力。

綜上所述,PCOS造模采用最多的是雄激素及來曲唑構(gòu)建模型,并且對(duì)于藥物劑量及干預(yù)時(shí)長(zhǎng)較統(tǒng)一穩(wěn)定。在動(dòng)物造模時(shí)盡量選用比較成熟的造模方法,以保證造模的成功,同時(shí)亦需要不斷地嘗試和探索新的造模方法,以求建立更符合臨床特征的PCOS動(dòng)物模型。

利益沖突聲明:無。