• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    陜西省地方酸奶中乳酸菌的分離鑒定及耐藥性分析

    2016-05-20 09:42:21梁寧利巨亞杰馮艷蕓鞏蓬勃
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2016年5期
    關(guān)鍵詞:分離耐藥性

    梁寧利,巨亞杰,馮艷蕓,鞏蓬勃

    (寶雞出入境檢驗檢疫局,陜西寶雞 721006)

    ?

    陜西省地方酸奶中乳酸菌的分離鑒定及耐藥性分析

    梁寧利,巨亞杰,馮艷蕓,鞏蓬勃

    (寶雞出入境檢驗檢疫局,陜西寶雞721006)

    摘要:從5種陜西省市售地方酸奶中分離出乳酸菌,研究乳酸菌分離株對多西環(huán)素、萬古霉素、頭孢吡肟、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素以及紅霉素這7種抗生素的耐藥性。利用MRS培養(yǎng)基和MC培養(yǎng)基,通過劃線分離培養(yǎng)分離酸奶樣品中的乳酸菌,對分離株進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色初級鑒定,同時采用紙片擴散法進(jìn)行耐藥性對比。從5種品牌酸奶中共分離出5株菌株,包括桿菌4株、球菌1株,用紙片擴散法進(jìn)行耐藥性測定均沒有檢測到獲得性耐藥表型。

    關(guān)鍵詞:保加利亞乳桿菌;嗜熱鏈球菌;分離;耐藥性

    0 引言

    酸奶是以鮮奶為原料,經(jīng)過巴氏殺菌后添加發(fā)酵劑發(fā)酵后,再冷卻灌裝的一種發(fā)酵乳制品。乳酸菌作為主要發(fā)酵劑,因其良好的發(fā)酵性能和益生功效在發(fā)酵食品行業(yè)中占有不可替代的位置。乳酸菌是指發(fā)酵糖類,主要代謝產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌有較長的安全使用歷史,長期以來發(fā)酵產(chǎn)品中所使用的乳酸菌普遍被人們認(rèn)為是安全(Generally regarded as safe,GRAS)菌株,并且它還與人以及動物腸道內(nèi)生微生物群落存在著相互作用,產(chǎn)生益生作用,有益于人和動物的健康[2]。2002年,國際乳業(yè)聯(lián)合會公布的在發(fā)酵乳制品中有長期安全使用歷史的微生物名單中細(xì)菌有18個屬81個種,其中乳桿菌有36個種、雙歧桿菌有8個種[3]。德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌是目前制作酸奶的主要發(fā)酵劑,所有酸奶的標(biāo)簽上都標(biāo)注有這2種乳酸菌。

    近幾十年來,抗生素在醫(yī)療、獸醫(yī)以及動物飼料等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用,甚至出現(xiàn)了濫用現(xiàn)象,導(dǎo)致微生物耐藥問題日趨嚴(yán)重,使人們在應(yīng)對細(xì)菌感染疾病時將面臨前所未有的挑戰(zhàn)[4]。早期有關(guān)細(xì)菌耐藥的研究主要集中在病原微生物的研究上,但是近些年對于環(huán)境中的共生細(xì)菌以及以乳酸菌為代表的益生菌耐藥的關(guān)注越來越多[5-6]。在研究初期,學(xué)者們認(rèn)為,乳酸菌的耐藥對其定植于人類或動物腸道內(nèi)發(fā)揮益生功效有一定的幫助,但隨后越來越多的報道顯示乳酸菌的耐藥機制與許多病原菌的耐藥機制十分相似。已有報道稱某些乳酸菌攜帶耐藥基因且具有相應(yīng)的耐藥表型[7],如Mathur,Hummel以及Cataloluk等人就在發(fā)酵食品中檢測到紅霉素和四環(huán)素的耐藥基因[2,5,8];在生產(chǎn)酸奶用的乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的某些菌株中也檢測到一些耐藥基因[5]。這些乳酸菌作為益生菌在進(jìn)入人體后(尤其是腸道),有將耐藥基因水平傳播給體內(nèi)的其他細(xì)菌,包括條件致病菌和致病菌的可能性[9],從而對人類健康產(chǎn)生潛在的威脅。因此,是否具有耐藥性或攜帶耐藥基因已經(jīng)成為評價益生菌安全與否的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[10]。

    近年來,國內(nèi)外越來越多的研究表明,長期以來被認(rèn)為安全的、廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品領(lǐng)域的乳酸菌已經(jīng)產(chǎn)生耐藥并攜帶了相應(yīng)的耐藥基因。因此,通過研究陜西地區(qū)市售酸奶樣品中乳酸菌,對7種具有代表性奶牛常用抗生素的耐藥性進(jìn)行對比,為評價酸奶中乳酸菌菌株的安全性及篩選安全菌株提供一定的參考依據(jù)。

    1試驗材料與試劑

    1.1試驗材料

    5種陜西地方市售酸奶,購自寶雞人人樂超市,分別為A,B,C,D,E品牌。

    1.2試驗試劑

    蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、檸檬酸二胺、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫- 80、瓊脂、碳酸鈣、醋酸、大豆蛋白胨、乳糖、中性紅、蒸餾水、氯化鈉、甲苯胺藍(lán),以及K2HPO4,MgSO4·7H2O,MnSO4·4H2O均為市售分析純。

    1.3試驗儀器

    恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司產(chǎn)品;高壓滅菌鍋,日本ALP公司產(chǎn)品;PHS- 3C型pH計,上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品;雙人單面超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品;UX6200H型分析天平,北京賽多利斯儀器系列有限公司產(chǎn)品。

    2試驗方法

    2.1培養(yǎng)基的配制

    (1)MRS瓊脂培養(yǎng)基的配制。①材料:蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母粉5 g,K2HPO42 g,檸檬酸二胺2 g,乙酸鈉5 g,葡萄糖20 g,吐溫- 80 1 mL,瓊脂15~20 g,蒸餾水1 000 mL,MgSO4· 7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.25 g。②制法:將以上成分加入到蒸餾水中,加熱使完全溶解,調(diào)pH值6.2~6.4,分裝于三角瓶中,于121℃下高壓滅菌21 min。將MRS培養(yǎng)基用醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.4,制成酸化MRS培養(yǎng)基,將MRS培養(yǎng)基除去瓊脂,制得液態(tài)MRS培養(yǎng)基。

    (2)改良MC培養(yǎng)基的配制。①材料:大豆蛋白胨5.0 g,牛肉膏5.0 g,酵母粉5.0 g,葡萄糖20.0 g,乳糖20.0 g,碳酸鈣10.0 g,瓊脂15.0 g,中性紅0.05 g。②制法:將以上成分加入到蒸餾水中,加熱使完全溶解,調(diào)節(jié)pH值至6.0左右,于121℃條件下滅菌20 min。

    2.2酸奶梯度稀釋

    吸取1 mL酸奶于9 mL的生理鹽水中混勻,此為1×10-1稀釋液;再取1×10-1稀釋液1 mL于9 mL生理鹽水中,此為1×10-2稀釋液。以此類推,做到1×10-6梯度(此操作均在無菌條件下進(jìn)行)。

    2.3 5種品牌酸奶中乳酸菌的活菌數(shù)計數(shù)

    取上述6個連續(xù)稀釋度的稀釋液0.1 mL分別置于2個MRS瓊脂平板上,使用L形棒進(jìn)行表面涂布,倒置41℃兼性厭氧培養(yǎng)48 h(從樣品稀釋到平板涂布整個試驗過程要求在20 min內(nèi)完成)。選取菌落數(shù)為30~300的平板進(jìn)行計數(shù),計數(shù)方法是每1 mL樣品中的乳酸菌數(shù)=該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)×稀釋倍數(shù)。方法參考國標(biāo)GB/T 4789.35—2010。

    2.4 5種品牌酸奶中乳酸菌的分離純化

    乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上菌落特征見表1。

    表1 乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上菌落特征

    根據(jù)乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上菌落特征,挑選3個或3個以上可疑單菌落,嗜熱鏈球菌接種于MC培養(yǎng)基,保加利亞乳桿菌接種于加碳酸鈣(按3% M/V的量加入滅菌碳酸鈣)并酸化的MRS培養(yǎng)基,倒置41℃兼性厭氧培養(yǎng)48 h。

    2.5乳酸菌的純培養(yǎng)

    酸奶中保加利亞乳桿菌在酸化的MRS培養(yǎng)基上菌落直徑為1~3 mm,無色素,呈白色至淡灰色,菌落表面較粗糙,菌落周圍產(chǎn)生碳酸鈣的溶解圈[11]。酸奶中嗜熱鏈球菌在MC培養(yǎng)基上可見紅色菌落,表面光滑、邊緣整齊,菌落大小為2 mm左右[12]。每種菌種挑選3個可疑菌落接種于斜面培養(yǎng)基上,每個菌落接種3個斜面培養(yǎng)基,置于41℃下兼性厭氧培養(yǎng)48 h。

    2.6乳酸菌純種的形態(tài)鑒定

    從斜面培養(yǎng)基上選取單菌落進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。保加利亞乳桿菌菌體形態(tài)多樣,呈長桿狀,彎曲桿狀或短桿狀,無芽孢。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀,直徑0.5~2.0 mm,成對或呈鏈排列,無芽孢。

    2.7乳酸菌濃度的確定

    2.7.1接種

    用接種環(huán)無菌操作取保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌1~2環(huán)分別放入200 mL的MRS液體培養(yǎng)基中,于41℃下恒溫培養(yǎng)。

    2.7.2培養(yǎng)

    分別于0,4,6,8,10,12,16,20 h取出10 mL培養(yǎng)液放冰箱中儲存,待測定。

    2.7.3活菌計數(shù)

    將待測試樣進(jìn)行梯度稀釋至10-5,取0.2 mL按GB/T 4789.35—2010進(jìn)行乳酸菌活菌數(shù)檢驗,以活菌數(shù)為1.50×108CFU/mL的時間為最佳培養(yǎng)時間。

    2.8含菌培養(yǎng)基的制備

    用無菌棉簽沾取菌液,在試管內(nèi)壁擠壓出多余液體后,涂布MRS平板,連續(xù)涂布3次,每次旋轉(zhuǎn)60°,最后繞平板邊緣涂抹1周,將平皿蓋微開3~5 min,待培養(yǎng)基表面多余水分被吸收后,蓋上平皿蓋,配置好的菌懸液應(yīng)在15 min內(nèi)使用。

    2.9乳酸菌的耐藥性測定

    每個培養(yǎng)皿取一個位置為基準(zhǔn)點,并用記號筆在背面做上標(biāo)記,抗菌藥物紙片以順時針方向貼加,其順序為多西環(huán)素、萬古霉素、頭孢吡肟、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素以及紅霉素。用鑷子貼抗菌藥物紙片,每次鑷子夾紙片前灼燒滅菌,紙片貼上后輕壓確保其貼牢,紙片貼后位置不應(yīng)再移動。兩紙片中心距離>24 mm,紙片距平板內(nèi)緣>15 mm。置于41℃下兼性厭氧培養(yǎng)48 h。

    2.10乳酸菌耐藥性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

    用刻度尺量取抑菌環(huán)直徑,根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)報告[13]判斷細(xì)菌對該抗生素是敏感(susceptible S)、耐藥(resistant R)還是中介(intermediate I)。

    細(xì)菌耐藥性解讀標(biāo)準(zhǔn)見表2。

    表2 細(xì)菌耐藥性解讀標(biāo)準(zhǔn)

    3結(jié)果與分析

    3.1 5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量

    5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量見表3。

    表3 5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量

    由表3可以看出,A品牌酸奶中乳酸菌活菌數(shù)最多,其次是D品牌,乳酸菌數(shù)最少的是品牌E。國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的酸奶國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 4789.35—2010)中規(guī)定[14],產(chǎn)品中的乳酸菌數(shù)不得低于1×106CFU/mL。其中,低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的有1份樣品,這可能是由于該菌種的耐氧性能較差,而在試驗過程中無法提供嚴(yán)格厭氧環(huán)境;但也不排除在添加菌種的過程中,沒有做好品質(zhì)控制,混勻不均,致使不同批次產(chǎn)品中含有的益生菌數(shù)量不同;同時,也不排除菌株自身品質(zhì)的問題。

    3.2乳酸菌的初步鑒定

    從5種品牌分離純化菌株的初步鑒定試驗結(jié)果。

    菌株1.1122見圖1,菌株1.2122見圖2,菌株1.3121見圖3,菌株1.5121見圖4,菌株1.3232見圖5。

    圖1 菌株1.1122

    圖2 菌株1.2122

    圖3 菌株1.3121

    圖4 菌株1.5121

    圖5 菌株1.3232

    對酸奶樣品進(jìn)行分離后,共得到5株純菌株,其菌落特征與乳酸菌符合。甲苯胺藍(lán)染色鏡檢初步判斷其中菌株1.1122、菌株1.2122、菌株1.3121及菌株1.5121為桿菌,菌株1.3232為球菌,總之共獲得桿菌4株、球菌1株。獲得純的球菌明顯少于桿菌,原因可能是球菌對桿菌的依賴性更強,離開桿菌球菌很難生長;也可能是在分離過程中使用的培養(yǎng)基對球菌的選擇性更差。

    3.3細(xì)菌濃度的確定

    乳酸菌達(dá)到0.5麥?zhǔn)希?.50×108CFU/mL)濃度時所需要的培養(yǎng)時間見表4。

    表4 乳酸菌達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠞舛葧r所需要的培養(yǎng)時間

    由表4可以看出,對乳酸菌進(jìn)行液體培養(yǎng)后,乳酸菌的對數(shù)生長期在6~14 h,找到A,B,C這3種品牌的乳酸菌培養(yǎng)時間為8 h時,細(xì)菌濃度達(dá)1.50× 108CFU/mL;D與E這2種品牌的乳酸菌培養(yǎng)時間為10 h,細(xì)菌濃度達(dá)1.50×108CFU/mL。

    3.4乳酸菌的耐藥性測定結(jié)果

    菌株1.1122的耐藥性見圖6,菌株1.2122的耐藥性見圖7,菌株1.3121的耐藥性見圖8,菌株1.5121的耐藥性見圖9,菌株1.3232的耐藥性見圖10,乳酸菌的耐藥情況見表5。

    圖6 菌株1.1122的耐藥性

    圖7 菌株1.2122的耐藥性

    圖8 菌株1.3121的耐藥性

    圖9 菌株1.5121的耐藥性

    圖10 菌株1.3232的耐藥性

    表5 乳酸菌的耐藥情況

    由表5可以看出,5株菌株均對鏈霉素耐藥,沒有菌株對頭孢吡肟、四環(huán)素、紅霉素以及多西環(huán)素耐藥;以上結(jié)果與秦宇軒和李晶等人[15]的報道一致。3株菌株對慶大霉素和萬古霉素耐藥。所檢測的5株乳酸菌均對四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素表現(xiàn)為敏感,這與Charteris,Coppola和Zhou等人[16-18]的研究結(jié)果一致。乳酸菌對氨基糖苷類抗生素和萬古霉素的耐受性屬于天然耐藥,檢測的5株乳酸菌均對鏈霉素表現(xiàn)為耐藥,有3株對慶大霉素表現(xiàn)為耐藥,有3株對萬古霉素耐藥,以上結(jié)果與Mathur,Hummel和Danielsen等人[19-21]的報道一致。

    參考文獻(xiàn):

    [1]任大勇,李昌,秦艷青,等.乳酸菌益生功能及作用機制研究進(jìn)展[J] .中國獸藥雜志,2011,45(2):47-50.

    [2]周凌華,王豪,王蔭榆,等.功能性益生乳酸菌的研究進(jìn)展[J] .天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012(7):990-997.

    [3]吳妍妍,張文舉,胡猛,等.乳酸菌在動物營養(yǎng)中的研究進(jìn)展[J] .飼料博覽,2012(10):20-23.

    [4]Orberg P K,Sandine W E. Survey of antimicrobial resistance in lactic streptococci [J] . Applied and Environmental Microbiology,1985,49(3):538-542.

    [5]Hempel A S,Newberry S J,Maher A R,et al. Probiotics for the prevention and treatment of antibiotic-associated diarrhoea:a systematic review and meta-analysis [J] . The Journal of the American Medical Association,2012,307(18):1 959-1 969.

    [6]張灼陽,劉暢,郭曉奎.乳酸菌耐藥性的研究進(jìn)展[J] .中國微生態(tài)學(xué)雜志,2007,19(5):478-480.

    [7]馮大偉,周家春.益生乳酸菌的紙片擴散法藥敏性試驗評價[J] .微生物學(xué)通報,2010,37(3):454-464.

    [8]徐進(jìn),劉秀梅,楊寶蘭,等.中國常用益生菌菌種的耐藥性研究[J] .衛(wèi)生研究,2008,37(3):354-356.

    [9]李平蘭,潘偉好,呂艷妮,等.微生態(tài)制劑中常用乳酸菌對抗生素的藥敏性研究[J] .中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,9(1):16-20.

    [10]凡琴,劉書亮,李娟,等.中國市售酸奶乳酸菌的耐藥性分析[J] .衛(wèi)生研究,2012,41(3):476-479.

    [11]李平蘭,賀稚非.食品微生物學(xué)實驗原理與計數(shù)[M] . 第2版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2011:35-37.

    [12]彭磊,司麗紅.酸奶中嗜熱鏈球菌初步分離與鑒定[J] .現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011(15):359-360.

    [13]陳佳玉,梁勇.臨床檢驗實驗系列教程微生物學(xué)檢驗分冊[M] .杭州:浙江大學(xué)出版社,2010:7.

    [14]衛(wèi)生部. GB/T 4789.35—2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗-食品中乳酸菌檢驗[S] .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

    [15]秦宇軒,李晶.市售酸奶中乳酸菌的鑒定與耐藥性[J] .微生物學(xué)報,2013,53(8):889-897.

    [16]Charteris W P,Kelly P M,Morelli L,et al. Antibiotic susceptibilityofpotentiallyprobiotic Lactobacillusspecies [J] . Journal of Food Protection,1998,61(12):1 636-1 643.

    [17]Coppola R,Succi M,Tremonte P,et al. Antibiotic susceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from parmigiano reggiano cheese [J] . Le Lait,2005,85(3):193-204.

    [18]Zhou J S,Pillidge C J,Gopal,P K,et al. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains [J] . International Journal of Food Microbiology,2005,98(2):211-217.

    [19]Mathur S,Singh R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria a review [J] . International Journal of Food Microbiology,2005,105(3):281-295.

    [20]Hummel A S,Hertel C,Holzapfel W H. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria [J] . Applied and Environmental Microbiology,2007,73(3):730-739.

    [21]Danielsen M,Wind A. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents [J] . International Journal of Food Microbiology,2003,82(1):1-11.

    Shaanxi Province where the Separation of Lactic Acid Bacteria in Yogurt Identification and Drug Resistance Analysis

    LIANG Ningli,JU Yajie,F(xiàn)ENG Yanyun,GONG Pengbo
    (Baoji Entry- exit Inspection and Quarantine Bureau,Baoji,Shaanxi 721006,China)

    Abstract:This paper from 5 kinds of lactic acid bacteria is isolated in shaanxi provinces and cities selling place of yogurt,the separation of lactic acid bacteria strains to doxycycline,vancomycin,cefepime,gentamycin,tetracycline,streptomycin and erythromycin the 7 kinds of antibiotic resistance. Using MRS culture medium and cultivated by streak MC medium separation of lactic acid bacteria in yogurt samples,toluidine blue staining the primary identification of the isolates,resistance comparison by disc diffusion method at the same time. Isolated from five brand yogurt of the communist party of China from 5 strains,4 strains bacillus,staphylococcus aureus 1 strain,by disc diffusion method for determination of resistance acquired drug resistance phenotypes are not detected.

    Key words:Lactobacillus bulgaricus;Streptococcus thermophilic;separate;drug resistance

    作者簡介:梁寧利(1981—),女,本科,工程師,研究方向為食品檢測。

    收稿日期:2016- 01- 14

    文章編號:1671- 9646(2016)03a- 0040- 04

    中圖分類號:R155.5

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    doi:10.16693/j.cnki.1671- 9646(X).2016.03.011

    猜你喜歡
    分離耐藥性
    長絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析
    WHO:HIV耐藥性危機升級,普及耐藥性檢測意義重大
    刑事庭審中心主義視域下的“分離觀”
    中國油畫本土化的發(fā)展情況芻議
    轉(zhuǎn)型背景下的民辦高校管理理念創(chuàng)新
    融合與分離:作為一種再現(xiàn)的巫術(shù)、文字與影像世界的構(gòu)成
    高效液相色譜技術(shù)在石油化工中的應(yīng)用分析
    氣體分離提純應(yīng)用變壓吸附技術(shù)的分析
    科技視界(2016年20期)2016-09-29 11:02:20
    燒傷整形外科醫(yī)院感染的病原菌分布及耐藥性分析
    黄色 视频免费看| 午夜亚洲福利在线播放| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产在线观看jvid| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲av成人一区二区三| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品av视频在线免费观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成年免费大片在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 在线视频色国产色| 一个人免费在线观看电影 | 中文字幕高清在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日韩大码丰满熟妇| 女人被狂操c到高潮| 亚洲国产欧美网| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲熟女毛片儿| 我的老师免费观看完整版| 丁香欧美五月| 久久中文字幕人妻熟女| 国产成人欧美在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产成人精品无人区| 亚洲人与动物交配视频| 真人做人爱边吃奶动态| 91字幕亚洲| 九色成人免费人妻av| 久久九九热精品免费| 91大片在线观看| 在线a可以看的网站| 一区福利在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| www.熟女人妻精品国产| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲欧美日韩高清专用| xxx96com| 亚洲在线自拍视频| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 无人区码免费观看不卡| 搡老熟女国产l中国老女人| 波多野结衣高清无吗| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99精品久久久久人妻精品| 91大片在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产不卡一卡二| 狠狠狠狠99中文字幕| 老司机午夜福利在线观看视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 波多野结衣高清无吗| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 又爽又黄无遮挡网站| 一本大道久久a久久精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| av视频在线观看入口| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩成人在线观看一区二区三区| 免费搜索国产男女视频| 国产激情久久老熟女| 国产精品国产高清国产av| 亚洲成人精品中文字幕电影| 搡老妇女老女人老熟妇| www.熟女人妻精品国产| 午夜视频精品福利| 免费看美女性在线毛片视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲专区字幕在线| 欧美黑人精品巨大| 两性夫妻黄色片| 午夜精品一区二区三区免费看| 12—13女人毛片做爰片一| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜精品久久久久久毛片777| 看免费av毛片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 最近最新中文字幕大全免费视频| 91大片在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 久久久水蜜桃国产精品网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 岛国在线观看网站| 精品欧美国产一区二区三| 很黄的视频免费| 一进一出好大好爽视频| 亚洲国产精品合色在线| www.自偷自拍.com| 国产三级黄色录像| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美丝袜亚洲另类 | 床上黄色一级片| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜福利在线观看吧| 欧美国产日韩亚洲一区| 日韩中文字幕欧美一区二区| a级毛片a级免费在线| 两人在一起打扑克的视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产在线观看jvid| 免费搜索国产男女视频| 成人欧美大片| 亚洲美女黄片视频| a在线观看视频网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一区二区三区高清视频在线| a级毛片a级免费在线| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 天堂动漫精品| 黄色片一级片一级黄色片| netflix在线观看网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产亚洲精品久久久久5区| 精品日产1卡2卡| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品,欧美在线| 三级毛片av免费| 国产免费男女视频| 精品国产美女av久久久久小说| 日本一二三区视频观看| 在线观看舔阴道视频| 国产一区二区在线观看日韩 | 99热只有精品国产| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品免费视频内射| 听说在线观看完整版免费高清| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩欧美 国产精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 成人亚洲精品av一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产黄a三级三级三级人| 在线看三级毛片| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美成人午夜精品| 天天添夜夜摸| 日韩欧美在线二视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 露出奶头的视频| 91麻豆av在线| 91字幕亚洲| 大型av网站在线播放| 中文在线观看免费www的网站 | www国产在线视频色| 日韩精品中文字幕看吧| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产69精品久久久久777片 | 亚洲av成人精品一区久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 两个人视频免费观看高清| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品影院久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 一本大道久久a久久精品| 久久精品国产清高在天天线| 成年免费大片在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久中文字幕一级| 国产99久久九九免费精品| 日韩精品青青久久久久久| 欧美在线一区亚洲| 久久久久久久久中文| 午夜福利欧美成人| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 岛国在线观看网站| 亚洲精品色激情综合| aaaaa片日本免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲国产中文字幕在线视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品av久久久久免费| 色尼玛亚洲综合影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品影院久久| 久久精品成人免费网站| 欧美乱色亚洲激情| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩有码中文字幕| 亚洲成人免费电影在线观看| 大型av网站在线播放| 国产99久久九九免费精品| 美女午夜性视频免费| 精品欧美国产一区二区三| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| av有码第一页| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲乱码一区二区免费版| 日韩大码丰满熟妇| 成人国产综合亚洲| 舔av片在线| 黄色丝袜av网址大全| 男人舔奶头视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 成人精品一区二区免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲电影在线观看av| 黄频高清免费视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 日韩欧美三级三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 又大又爽又粗| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 久99久视频精品免费| 国产av一区在线观看免费| 国产午夜精品久久久久久| 久久久久久大精品| 久久这里只有精品19| 香蕉久久夜色| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 中文在线观看免费www的网站 | 色播亚洲综合网| 两个人看的免费小视频| 日本黄色视频三级网站网址| 岛国视频午夜一区免费看| 香蕉国产在线看| 久久久久久久久免费视频了| 岛国在线观看网站| av在线播放免费不卡| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久久国产一级毛片高清牌| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久天堂一区二区三区四区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲电影在线观看av| 天堂√8在线中文| 很黄的视频免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 色噜噜av男人的天堂激情| 精品久久久久久久末码| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费在线观看影片大全网站| a级毛片a级免费在线| 99久久综合精品五月天人人| 黄色成人免费大全| 亚洲国产精品999在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 禁无遮挡网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产一区二区三区视频了| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产亚洲精品久久久久5区| 成人国语在线视频| 看片在线看免费视频| 亚洲电影在线观看av| 久久99热这里只有精品18| 国产精品精品国产色婷婷| 三级毛片av免费| 欧美乱色亚洲激情| av国产免费在线观看| 99riav亚洲国产免费| 成人18禁在线播放| 亚洲专区国产一区二区| 村上凉子中文字幕在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 脱女人内裤的视频| 亚洲精品在线观看二区| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产伦在线观看视频一区| 丁香欧美五月| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产激情偷乱视频一区二区| 日本五十路高清| 亚洲av熟女| 天堂影院成人在线观看| 全区人妻精品视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产麻豆成人av免费视频| 久久 成人 亚洲| 久久久国产欧美日韩av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美久久黑人一区二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久精品成人免费网站| 男男h啪啪无遮挡| 一a级毛片在线观看| 成年人黄色毛片网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| av福利片在线| 男女视频在线观看网站免费 | 老熟妇仑乱视频hdxx| videosex国产| 91麻豆av在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产高清视频在线观看网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 无限看片的www在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品一及| 精品久久久久久久末码| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产亚洲精品一区二区www| 国产精品影院久久| 一二三四社区在线视频社区8| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 超碰成人久久| 床上黄色一级片| 99久久国产精品久久久| 手机成人av网站| 亚洲激情在线av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲熟妇熟女久久| 免费看日本二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久精品综合一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一夜夜www| 午夜成年电影在线免费观看| 国产高清视频在线播放一区| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲中文字幕日韩| 亚洲av美国av| 两人在一起打扑克的视频| 欧美成人午夜精品| 欧美日韩乱码在线| 日本一本二区三区精品| 国产男靠女视频免费网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 视频区欧美日本亚洲| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲精品在线美女| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| svipshipincom国产片| av天堂在线播放| 两性夫妻黄色片| 亚洲国产精品合色在线| 天堂√8在线中文| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 美女黄网站色视频| 99久久精品国产亚洲精品| 黄色成人免费大全| 国产精品av久久久久免费| 国产精品一区二区免费欧美| 男人舔奶头视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 麻豆一二三区av精品| 午夜a级毛片| 午夜福利在线观看吧| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产成人影院久久av| 黑人操中国人逼视频| 一a级毛片在线观看| bbb黄色大片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产高清videossex| 精品电影一区二区在线| 天堂动漫精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美日韩黄片免| 国产成人影院久久av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 18禁国产床啪视频网站| 精品日产1卡2卡| 神马国产精品三级电影在线观看 | 一级毛片精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久国产成人精品二区| 两个人的视频大全免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产亚洲精品一区二区www| 88av欧美| 又爽又黄无遮挡网站| 动漫黄色视频在线观看| 香蕉丝袜av| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 无人区码免费观看不卡| av免费在线观看网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品一区av在线观看| 日韩av在线大香蕉| 搞女人的毛片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美极品一区二区三区四区| 国产视频一区二区在线看| 日本免费a在线| 级片在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 操出白浆在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 久久久久久久久久黄片| 中出人妻视频一区二区| 日韩免费av在线播放| 两性夫妻黄色片| 欧美日韩精品网址| 精品免费久久久久久久清纯| 中文字幕av在线有码专区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美成狂野欧美在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 90打野战视频偷拍视频| 首页视频小说图片口味搜索| 麻豆成人av在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 丁香六月欧美| 免费高清视频大片| 国产av一区在线观看免费| 国产三级在线视频| 午夜老司机福利片| netflix在线观看网站| 国产免费av片在线观看野外av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产高清激情床上av| 精品日产1卡2卡| 五月伊人婷婷丁香| 久久草成人影院| 全区人妻精品视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲av熟女| 人人妻人人看人人澡| 一进一出好大好爽视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产91精品成人一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| a级毛片在线看网站| 欧美日韩精品网址| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产黄色小视频在线观看| 国产99久久九九免费精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲美女视频黄频| 欧美中文日本在线观看视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 啪啪无遮挡十八禁网站| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲七黄色美女视频| 色综合婷婷激情| 九色成人免费人妻av| 国产av一区在线观看免费| 99re在线观看精品视频| 欧美中文综合在线视频| 国产不卡一卡二| 日韩欧美在线二视频| 成人三级黄色视频| 国产视频内射| 国产野战对白在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美黑人巨大hd| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲,欧美精品.| 99久久综合精品五月天人人| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本一区二区免费在线视频| ponron亚洲| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日本a在线网址| 757午夜福利合集在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 久久久久久久久中文| 长腿黑丝高跟| 制服人妻中文乱码| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美色欧美亚洲另类二区| 我的老师免费观看完整版| 禁无遮挡网站| 国产精品综合久久久久久久免费| 午夜免费激情av| 亚洲av五月六月丁香网| 男女视频在线观看网站免费 | 日韩高清综合在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜福利免费观看在线| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产成人啪精品午夜网站| 日本五十路高清| 亚洲人成电影免费在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 后天国语完整版免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| e午夜精品久久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品久久蜜臀av无| 亚洲精品在线观看二区| 1024手机看黄色片| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产成人av教育| 在线观看免费视频日本深夜| 色精品久久人妻99蜜桃| 成年版毛片免费区| 久久亚洲真实| 久久国产精品影院| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲专区中文字幕在线| 国产av又大| 日本黄大片高清| 操出白浆在线播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产高清视频在线播放一区| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费看十八禁软件| 不卡一级毛片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲精品在线观看二区| 欧美3d第一页| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 天天添夜夜摸| 亚洲色图av天堂| 国产成人影院久久av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成人手机av| 神马国产精品三级电影在线观看 | 身体一侧抽搐| 99久久国产精品久久久| 色在线成人网| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品,欧美在线| 亚洲av成人精品一区久久| 舔av片在线| 亚洲av五月六月丁香网| 岛国在线免费视频观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲专区字幕在线| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 俺也久久电影网| 午夜福利高清视频| av片东京热男人的天堂| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 男女床上黄色一级片免费看| 久久人妻av系列| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲av片天天在线观看| 国产成人精品无人区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久香蕉激情| 无遮挡黄片免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲一区二区三区不卡视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 麻豆成人av在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 国产一区在线观看成人免费| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产高清视频在线观看网站| 天堂影院成人在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 久久久精品大字幕| 听说在线观看完整版免费高清| 无限看片的www在线观看| 成在线人永久免费视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 中国美女看黄片| 97碰自拍视频| 欧美一级毛片孕妇| 黄片小视频在线播放|