盆炎方對(duì)盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織TNF-α、EGF蛋白表達(dá)的影響

戴　月，匡繼林*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410005）

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盆炎方對(duì)盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織TNF-α、EGF蛋白表達(dá)的影響

戴月1，匡繼林2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410005）

〔摘要〕目的觀察盆炎方對(duì)盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）蛋白表達(dá)的影響。方法以“機(jī)械性損傷+混合菌種接種法”建立盆腔炎性疾病后遺癥SD雌性大鼠子宮模型。造模成功后隨機(jī)分為模型對(duì)照組、婦科千金膠囊組及盆炎方高、中、低劑量組，另設(shè)空白對(duì)照組和假手術(shù)組共計(jì)7組，每組8只。分別以盆炎方高、中、低劑量藥液、婦科千金混懸液及同等體積蒸餾水灌胃21 d。采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠子宮組織中TNF-α、EGF蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果與模型組比較，盆炎方各劑量組大鼠子宮組織的TNF-α表達(dá)明顯降低（P<0.05）；盆炎方中、高劑量組大鼠子宮組織的EGF蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；結(jié)論盆炎方高劑量組能夠顯著降低盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮中TNF-α的表達(dá)，明顯增強(qiáng)盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮中EGF的表達(dá)，盆炎方對(duì)盆腔炎性疾病后遺癥有積極治療作用。

〔關(guān)鍵詞〕盆腔炎性疾病后遺癥；盆炎方；腫瘤壞死因子-α；表皮生長(zhǎng)因子；大血藤；敗醬草

盆腔炎性疾病后遺癥（sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID）是指女性上生殖道及盆腔周圍結(jié)締組織的一種慢性炎癥[1]。是婦科的常見(jiàn)病、多發(fā)病。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作為一種促炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)機(jī)體遭遇急、慢性炎性反應(yīng)或免疫反應(yīng)時(shí)，它可根據(jù)程度不同而做出不同反應(yīng)。罹患盆腔炎性疾病后遺癥，多由于自身免疫力下降，對(duì)于外來(lái)疾病的防御力減弱，致使盆腔組織容易受到細(xì)菌、微生物等的混合感染，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)子宮內(nèi)膜組織、宮旁組織及盆腔結(jié)締組織后產(chǎn)生炎性滲出、纖維化、粘連等一系列炎癥表現(xiàn)。表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）對(duì)上皮細(xì)胞具有修復(fù)作用[2]。在其作用之下，能夠加速細(xì)胞增殖，使已經(jīng)分化成熟的細(xì)胞不斷生成新生細(xì)胞，從而替代衰老及凋亡細(xì)胞，起到修復(fù)與再生的作用。

盆炎方是湖南省中醫(yī)院名老中醫(yī)謝劍南教授在臨床治療SPID的經(jīng)驗(yàn)效方,已臨床效驗(yàn)多年，臨床觀察發(fā)現(xiàn)本方對(duì)濕熱瘀結(jié)型SPID療效顯著[3]，但藥理作用機(jī)制、作用原理尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)采用“機(jī)械性損傷+混合菌種接種法”制備SPID大鼠子宮模型，并對(duì)盆炎方各劑量組干預(yù)治療后的盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織中炎性因子TNF-α及EGF蛋白表達(dá)的差異性進(jìn)行觀察，從而探討盆炎方治療該病的作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性、健康未孕的SD大鼠60只，體質(zhì)量（205.72±16.36）g，鼠齡8～12周，購(gòu)自湖南斯達(dá)克景實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及菌種

干預(yù)用中藥：盆炎方，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供。藥物組成：大血藤20 g,敗醬草15 g,虎杖15 g,續(xù)斷15 g,杜仲15 g,當(dāng)歸10 g,赤芍10 g,丹參10 g,澤蘭10 g,香附10 g,牡丹皮10 g,生蒲黃10 g,三七粉6 g,乳香5 g,沒(méi)藥5 g,甘草5 g。陽(yáng)性對(duì)照藥：婦科千金膠囊，由株洲千金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。0.4 g/粒。金黃色葡萄球菌（ATCC131101）、大腸桿菌（ATCC131102）、乙型溶血性鏈球菌（ATCC131103）按照為1∶1∶2配成30×108/mL濃度的混合細(xì)菌懸液。實(shí)驗(yàn)菌種由湖南中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室提供。

1.3試劑

TNF-α檢測(cè)試劑盒、EGF檢測(cè)試劑盒（均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）。

2方法

2.1模型建立

在以往細(xì)菌感染致炎的基礎(chǔ)上，加用機(jī)械性損傷子宮內(nèi)膜的因素來(lái)制備SPID大鼠子宮模型[4-5]。使用2％戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射以麻醉大鼠(40 mg/kg)，待麻醉生效后，用橡皮筋牽拉大鼠四肢并固定于實(shí)驗(yàn)解剖盤上，剪去下腹部被毛。在相對(duì)無(wú)菌條件下，取大鼠下腹正中切口約0.8～1 cm，開(kāi)腹后暴露Y型子宮。在注入菌液之前用無(wú)菌注射器機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜（注射器磨去針尖并輕柔來(lái)回搔刮左側(cè)子宮），然后用1 mL注射器抽取0.2 mL混合細(xì)菌懸液[6](金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乙型溶血性鏈球菌以1∶1∶2的比例溶于無(wú)菌生理鹽水配成30×108/mL濃度的混合細(xì)菌懸液)，向大鼠左側(cè)輸卵管-卵巢方向緩慢推注，注畢，用眼科鑷夾閉針孔，防止菌液溢出。分層關(guān)腹，用2％碘酊消毒術(shù)區(qū)。假手術(shù)組將大鼠麻醉后，依據(jù)上述步驟開(kāi)腹，不做任何損傷性操作，直接分層縫合術(shù)野；空白組不造模。

2.2分組

將60只SD雌性大鼠隨機(jī)分為空白組8只、假手術(shù)組8只、模型對(duì)照組44只。觀察性喂養(yǎng)第15天，隨機(jī)抽取模型對(duì)照組大鼠4只行造模評(píng)價(jià)，待造模評(píng)價(jià)提示造模成功后，再隨機(jī)將模型對(duì)照組大鼠分成：盆炎方高劑量組、中劑量組、低劑量組、婦科千金膠囊組、模型對(duì)照組，每組各8只。

2.3給藥

盆炎方每劑含生藥171 g，婦科千金膠囊每日服用劑量2.4 g。按成人平均體質(zhì)量為60 Kg計(jì)算，根據(jù)“人和動(dòng)物間體表面積折算給藥劑量比率表[7]”折算成成人等效劑量的0.5、1、2倍，分別為盆炎方高劑量組3.56 g/Kg、中劑量組1.78 g/Kg、低劑量組0.89 g/Kg、婦科千金膠囊組0.22 g/Kg灌胃給藥；上述各組給藥體積均為1 mL/100 g?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型對(duì)照組分別給予以等容量蒸餾水灌胃，給藥體積均為1 mL/100 g。每日1次（上午8：00-9：30），連續(xù)給藥21 d。每周稱質(zhì)量1次，根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化予以調(diào)整相應(yīng)給藥量。

2.4取材方法

相對(duì)無(wú)菌條件下取出完整的大鼠子宮，用10％福爾馬林溶液浸泡固定標(biāo)本，經(jīng)脫水透明，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)連續(xù)切片制成厚約5 μm的石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色和免疫組化檢測(cè)。

2.5免疫組化法

依據(jù)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行以下操作：將載玻片用APES防脫片劑處理，撈片后置烤箱58～60℃30～60 min以使切片緊密黏附；切片常規(guī)脫蠟至水化；3％H2O2去離子水（無(wú)色液體），室溫孵育5～10 min以消滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS沖洗，3 min×3次；滴加試劑A（藍(lán)色液體）室溫孵育10～15 min，傾去，勿洗；按比例稀釋的一抗，37℃孵育2～3 h或4℃過(guò)夜；PBS沖洗，3 min×3次；滴加試劑B（黃色液體），室溫或37℃孵育5～10 min；PBS沖洗，3 min×3次；滴加試劑C（橙色液體），室溫或37℃孵育10～15 min；PBS沖洗，3 min×3次；顯色劑顯色（DAB或AEC）；自來(lái)水充分沖洗。封片。

2.6結(jié)果判定

上述染色均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照片和陰性對(duì)照片，陽(yáng)性對(duì)照片為已知切片，陰性對(duì)照片為PBS替代一抗，顯微鏡觀察，陽(yáng)性結(jié)果為：胞漿、胞核、胞膜為棕黃色顆粒。鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，陽(yáng)性顆粒定位好，染色高于背景。免疫組化陰性無(wú)染色。采用Motic B5顯微攝像系統(tǒng)拍照，400倍視野下每個(gè)切片隨機(jī)攝取4個(gè)視野，用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值，信號(hào)強(qiáng)度用平均灰度值表示，平均灰度值越大，說(shuō)明表達(dá)越強(qiáng)。

2.7統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料以“±s”進(jìn)行表示。先檢驗(yàn)樣本驗(yàn)方差齊性。如果符合正態(tài)性和方差齊性，可采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，并進(jìn)行組間的多重比較；如果不符合正態(tài)性和方差齊性時(shí)，可采用Dunnett t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)[8-9]

肉眼觀察：子宮形態(tài)異常（迂曲或擴(kuò)張）、子宮充血、腫脹、積液、積膿或與盆腔周圍組織發(fā)生粘連；盆腔積液。病理學(xué)觀察：宮腔積液、擴(kuò)張或粘連、腔壁結(jié)構(gòu)紊亂、固有層變薄或消失、上皮細(xì)胞脫落或壞死、內(nèi)膜水腫或充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脫落等。見(jiàn)圖1。

圖1　SPID模型病理顯微光鏡圖（HE染色×400）

3.2各組間大鼠子宮組織中TNF-α蛋白表達(dá)

與空白組、假手術(shù)組比較，所有致病大鼠子宮組織中TNF-α表達(dá)均增加，以模型對(duì)照組最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示模型造模成功；與模型對(duì)照組比較，盆炎方低、中、高劑量組及婦科千金膠囊組子宮組織的TNF-α表達(dá)明顯下降（P<0.05）；與婦科千金膠囊組比較，盆炎方低、中劑量組的TNF-α蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；盆炎方高劑量組與婦科千金膠囊組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。通過(guò)盆炎方低、中、高劑量組及婦科千金膠囊干預(yù)治療后的盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織中TNF-α蛋白表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果見(jiàn)表1，圖2。

圖2　各組免疫組化TNF-α光鏡圖（×400）

3.3各組間大鼠子宮組織中EGF蛋白表達(dá)

與空白組、假手術(shù)組比較，所有致病大鼠子宮組織中EGF表達(dá)均下降，以模型對(duì)照組最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示模型造模成功；與模型對(duì)照組比較，盆炎方中、高劑量組子宮組織的EGF蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與婦科千金膠囊組比較，盆炎方低、中、高劑量組子宮組織的EGF蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P=0.410>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1，圖3。

表1　各組SPID大鼠子宮中TNF-α、EGF蛋白表達(dá)（灰度值，±s，n=8）

表1　各組SPID大鼠子宮中TNF-α、EGF蛋白表達(dá)（灰度值，±s，n=8）

注：與空白組、假手術(shù)組比較，△P<0.05；與模型對(duì)照組比較，▲P<0.05。

組別空白組假手術(shù)組模型對(duì)照組婦科千金組盆炎方低劑量組盆炎方中劑量組盆炎方高劑量組F值給藥劑量（g/Kg）---2.2 8.9 17.8 35.6 TNF-α 129.2±17.9 132.6±19.8 192.9±15.5△142.8±9.7△▲171.9±16.3▲* 155.3±11.6▲* 147.8±29.8△▲30.174 EGF 207.0±10.7 192.4±9.9 149.2±31.4△176.4±11.5△▲151.6±17.9▲166.3±9.2▲178.9±16.0△▲21.334

圖3　各組免疫組化EGF光鏡圖（×400）

4討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)盆腔炎性疾病后遺癥的認(rèn)識(shí)尚未形成完善的理論體系，但在千年以前就有“婦人腹痛”、“熱入血室”、“癥瘕”、“帶下病”等病名，且這些病名所特有的臨床表現(xiàn)多歸屬于SPID的范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病主要機(jī)制為沖任阻滯，胞脈失暢；或沖任虛損，胞脈失養(yǎng)?！芭柩追健痹綖槊现嗅t(yī)謝劍南教授治療盆腔炎性疾病后遺癥的經(jīng)驗(yàn)效方。導(dǎo)師匡繼林教授在沿襲傳統(tǒng)的基礎(chǔ)上，不斷加以總結(jié)及化裁，方得今日之“盆炎方”。全方重在清利濕熱、活血化瘀，臨床對(duì)濕熱瘀結(jié)型盆腔炎性疾病后遺癥收效顯著。本方以清利濕熱、活血祛瘀之紅藤、敗醬草為君，當(dāng)歸補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛，赤芍活血化瘀，丹參祛瘀止痛，三七化瘀止血、活血定痛，虎杖清熱解毒，牡丹皮清熱涼血祛瘀。六藥為臣，配合君藥清利濕熱，并活血化瘀。乳香、沒(méi)藥為佐助藥，二者相須為用，治療瘀血阻滯所致諸痛癥，增強(qiáng)臣藥之行氣活血之效。生蒲黃重在化血瘀配合澤蘭通利小便，使?jié)駨南露?，香附舒肝理氣止痛。甘草為使，調(diào)和諸藥。以上諸藥合用，使得濕去熱清，瘀除絡(luò)通。更體現(xiàn)祛瘀不傷正、扶正不留邪的組方理念。

TNF-α主要有輔助T1細(xì)胞分泌[10]。它可能直接刺激中性細(xì)胞脫顆粒和“呼吸鏈”產(chǎn)生大量過(guò)氧化氫等自由基，導(dǎo)致炎癥局部的組織損傷。它可通過(guò)激活細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)而誘發(fā)全身炎性反應(yīng)[11]。TNF-α在空白組大鼠子宮組織中僅有少量表達(dá)，而在模型對(duì)照組大鼠子宮中的表達(dá)顯著升高。經(jīng)盆炎方干預(yù)治療后，大鼠子宮組織中TNF-α表達(dá)較前降低，其中以盆炎方高劑量組尤為明顯,且TNF-α的表達(dá)水平差異與盆炎方的劑量呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，炎性介質(zhì)可以上調(diào)TNF-α的表達(dá)，而通過(guò)盆炎方高劑量組治療可有效降低TNF-α表達(dá)，從而起到降低炎癥反應(yīng)發(fā)生的作用。婦科千金膠囊是臨床治療盆腔炎性疾病后遺癥的經(jīng)典常用中成藥，對(duì)于濕熱瘀結(jié)型療效顯著，故選為本研究陽(yáng)性對(duì)照藥，婦科千金膠囊與盆炎方高劑量組均可顯著降低模型大鼠子宮組織中TNF-α表達(dá)量，兩者表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故提示二者有類似的藥理學(xué)效應(yīng)。EGF本身是一種強(qiáng)而有力的細(xì)胞分裂促進(jìn)因子，能夠刺激機(jī)體內(nèi)多種類型組織細(xì)胞的分裂及增生，具有十分廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[12]。EGF表達(dá)增強(qiáng)可以促進(jìn)上皮增殖、維護(hù)組織修復(fù)和細(xì)胞保護(hù)的作用。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)觀察顯示，盆腔炎性疾病后遺癥模型大鼠子宮組織中EGF蛋白表達(dá)在造模后明顯降低，在使用盆炎方藥物干預(yù)后表達(dá)顯著升高?？紤]盆腔炎性疾病后遺癥大鼠模型的盆腔炎癥的程度與EGF表達(dá)水平密切相關(guān)。若能在疾病發(fā)生早期糾正EGF表達(dá)可能會(huì)是減輕盆腔粘連，預(yù)防和降低盆腔炎性疾病后遺癥發(fā)生率的重要環(huán)節(jié)之一，從而達(dá)到治療目的，而采用盆炎方治療是可靠的治療用藥之一。綜上所述，“盆炎方”活血化瘀、清熱利濕效果明顯。該方作用機(jī)制可能與減輕炎性反應(yīng)、增強(qiáng)組織修復(fù)相關(guān)，這可能是盆炎方發(fā)揮抗炎作用的有效機(jī)制之一。

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（本文編輯楊瑛）

·基礎(chǔ)研究·

The Influence of Penyan Decoction on the TNF-α and EGF Expression of Uterus in Rats with Pelvic Inflammatory Disease Sequelae

DAI Yue1，KUANG Jilin2*
（1. Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410005, China）

Abstract〔〕Objective To observe the influence of Penyan decoction (PYD) on the TNF-α and EGF expression of uterus in rats with pelvic inflammatory disease sequelae. Methods The uterus model rats with pelvic inflammatory disease sequelae were established by using "the mechanic injury and mixed bacteria inoculation" method. The successful model rats were randomly divided into model group, Fuke Qianjin capsule group, and high, medium and low dose of PYD groups and PYD low dose group, rats were also assigned into sham-operation group and normal control group, 8 rats in each group. The rats were intragastric administration with high, medium, low dose PYD liquid, Fufang Qianjin capsule and the same volume of distilled water for 21 days, respectively. The TNF-α and EGF expression of rats in all groups were detected by using the immunohisto chemical method. Results Compared with the model group, the expression of TNF-α was significantly decreased in the rats with different dose groups (P<0.05); the expression of EGF in medium dose group and high dose group was significantly higher (P<0.05). Conclusion PYF group with high dose could significantly reduce the expression of TNF-α and increase the expression of EGF in uterus of rats with pelvic inflammatory disease sequelae，and the PYD show positive treatment effect on sequelae of pelvic inflammatory disease.

Keywords〔〕sequelae of pelvic inflammatory disease；Penyan Decoction；TNF-α；EGF；Sargentodoxa cuneata；Dahurian patrinia herb

〔通訊作者〕*匡繼林，女，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：kuangjlabc@tom.com。

〔作者簡(jiǎn)介〕戴月，女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治不孕不育癥的研究。

〔基金項(xiàng)目〕謝劍南名老中醫(yī)傳承工作室資助項(xiàng)目。

〔收稿日期〕2015-10-03

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.004