人非小細胞肺癌A549細胞異質性研究

石興源 艾亮梅 黃文瑾 聶 豪 余宏偉 蔡隆梅 周同沖 傅文凡

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療四科，廣東 廣州 510095)

·論著·

人非小細胞肺癌A549細胞異質性研究

石興源*艾亮梅 黃文瑾 聶 豪 余宏偉 蔡隆梅 周同沖 傅文凡

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療四科，廣東 廣州 510095)

目的:分析肺癌A549細胞的異質性特征。方法：有限稀釋法分離A549細胞的單個克隆細胞并擴大培養(yǎng)，對親代與子代細胞進行生長、轉移等特征的分析，了解A549細胞內部存在的異質性特征。結果：共獲得6個A549細胞子細胞株，與親代細胞比較，各子代細胞在細胞增殖能力和轉移特征方面存在明顯差異(P<0.05)。結論：A549細胞存在細胞增殖能力和轉移特征的異質性，可能與腫瘤的發(fā)生轉移相關。

非小細胞肺癌；腫瘤異質性

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌的85%左右，是一種威脅人類健康的惡性腫瘤之一。手術、放療、化療和靶向治療是目前NSCLC治療的主要手段，其中后兩種治療方式是NSCLC全身治療的兩種主要方式[1]。對于化療來說，含鉑兩藥方案為臨床主要使用的化療方案。而對于靶向治療來說，針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)標靶的小分子酪氨酸激酶活性抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)靶向治療是目前臨床應用最多的。然而，對于這兩種主要的NSCLC全身治療方法，耐藥是一個難以回避的問題[2-3]。目前的研究顯示，NSCLC的化療與靶向治療耐藥機制主要包括：多種蛋白、酶和基因綜合作用的結果,靶分子出現(xiàn)繼發(fā)改變,信號轉導旁路激活,微環(huán)境變化等。除此之外，也有研究顯示腫瘤細胞的克隆異質性也與NSCLC的化療與靶向治療耐藥相關。

腫瘤的異質性是指腫瘤在發(fā)生與發(fā)展過程中，其不同腫瘤子細胞呈現(xiàn)出分子生物學或基因方面的改變，從而使腫瘤呈現(xiàn)不同的生長、侵襲、藥物敏感性、預后等特性。腫瘤的異質性包括空間異質性和時間異質性。所謂空間異質性主要指在相同時間點的同一腫瘤內或不同腫瘤病灶間的腫瘤子細胞的差異性，而時間異質性則是指當腫瘤在接受藥物治療等情況下出現(xiàn)腫瘤微環(huán)境變化而導致的在不同時間點的腫瘤子細胞的差異性。而這不同的腫瘤異質性特征導致了同種腫瘤可呈現(xiàn)顯著差異的臨床表型。相關文獻報道，在EGFR基因突變檢測結果為存在敏感突變的NSCLC患者中，接受TKI治療時的藥物反應性卻存在較大的差異。同時，當TKI治療了一段時間患者開始出現(xiàn)耐藥表現(xiàn)時，其具體的表現(xiàn)形式也存在明顯差異，可分為爆發(fā)進展、緩慢進展和局部進展三種模式[4]，而針對這不同的耐藥模式，臨床也采取了相應的不同治療方案來給予患者個體化治療。因此，發(fā)現(xiàn)更多的NSCLC患者可能存在的腫瘤異質性特征對于腫瘤的療效與預后預測和指導個體化治療具有重要意義。

本研究擬以人非小細胞肺癌細胞系A549為研究對象，結合有限稀釋法建立多個單克隆化的子細胞株，并對其進行表型和基因型分析，為后續(xù)研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

美國Life公司：1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶；美國Promega公司：MTS；美國SHELLAB公司：CO2培養(yǎng)箱；德國徠卡公司：DMI4000B倒置顯微鏡；美國BioTek公司：Synergy2多功能酶標儀。

1.2 細胞培養(yǎng)

A549在中科院上海細胞所購買。細胞置于1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 有限稀釋法

將對數(shù)生長期的A549細胞用胰酶處理后獲得細胞懸液，利用1640培養(yǎng)基將細胞稀釋至每200 μL生含1個細胞的濃度，將稀釋后細胞按每孔200 μL的量分裝至整塊96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。挑選含單個細胞克隆的孔待細胞長滿后轉6孔板做擴大培養(yǎng)以建立子細胞株。

1.4 大體觀察

顯微鏡下觀察各細胞克隆形態(tài)特征。

1.5 克隆形成實驗

將待檢細胞稀釋，其后按400個細胞/孔接種6孔培養(yǎng)板，每個細胞設3復孔，培養(yǎng)8天后棄上清，預冷甲醇固定30分鐘，結晶紫染色后清水沖洗、晾干。計數(shù)克隆數(shù)以及克隆形成率(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%)。

1.6 細胞增殖曲線

稀釋待檢細胞，按1000個細胞/200 μL/孔濃度接種96孔板，每個時間點設置5個檢測復孔，在接種細胞貼壁后分別在0、24、48、72、96、120 h加MTS37 ℃放置3 h后測吸光度值(A)，利用各時間點測量值均值繪制細胞增殖曲線。

1.7 劃痕實驗

稀釋待檢細胞，取3×105細胞接種6孔板，待細胞鋪滿培養(yǎng)孔底后更換無血清培養(yǎng)基，其后用小吸頭垂直劃線，0、24、48定位觀察細胞遷移情況。

1.8 基因突變檢測

依據EGFR基因突變檢測試劑盒(直接測序法)說明書步驟檢測各子細胞克隆的EGFR基因突變情況，觀察是否存在EGFR基因異質性情況。

1.9 統(tǒng)計分析

應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件處理相關數(shù)據。計量資料以表示，采用單因素方差分析比較組間差異。

2 結 果

2.1 大體觀察結果

通過有限稀釋法自A549細胞中得到20個單細胞培養(yǎng)孔，其中僅6個孔的單細胞最終成長形成克隆并擴大培養(yǎng)獲得子代細胞(分別標記為1-6號克隆)，占比30%。在單細胞首次形成克隆時，不同克隆具有兩種不同的克隆形態(tài)，第一種克隆形態(tài)為緊密型克隆，克隆內細胞結合緊密，克隆邊界清晰。第二種克隆形態(tài)為散在型克隆，細胞間結合松散。見圖1。在所獲得的6個子克隆中：2、3、5、6號克隆為緊密型克隆，占66.7%；1、4號克隆為散在型克隆，占33.3%。

BA

A.緊密型克隆;B.散在型克隆

圖1 A549單細胞形成的子克隆形態(tài)

2.2 克隆形成實驗結果

A549的克隆形成率為(52.6±3.4)%；1-6號子細胞的克隆形成率分別為：(25.3±4.8)%、(70.2±5.4)%、(50.2±4.4)%、(12.2±5.6)%、(44.4±3.4)%、(66.5±3.9),存在明顯差異(P<0.05)。

2.3 細胞生長曲線

通過生長曲線可見A549細胞與2、3、6號克隆顯示出較強的增殖活性，其中2號克隆最強，而1、4號克隆的增殖活性較弱。見圖2。

76543210244872960120t/min增殖倍數(shù)NCI-A5491號克隆2號克隆3號克隆4號克隆5號克隆6號克隆

圖2 細胞增殖曲線

2.4 劃痕實驗結果

2號克隆48小時劃痕兩側細胞相接，A549與其他克隆48 h劃痕兩側細胞仍未相接，故存在差異。

2.5 EGFR基因突變檢測結果

利用直接測序法對A549與1-6號克隆細胞的EGFR基因(18-21外顯子)突變狀態(tài)進行檢測，所有細胞的18-21外顯子均為野生型，未見差異。

3 討 論

關于腫瘤異質性的來源有兩種不同假說，其一為克隆演化假說，其二為腫瘤干細胞假說[5]?？寺⊙莼僬f認為雖然大多數(shù)腫瘤在發(fā)生時多為單克隆起源，但在發(fā)展過程中，在腫瘤細胞內存在著的克隆演化過程導致了腫瘤產生了異質性，也即逐步體現(xiàn)為多克隆性，其中占主導的克隆形成腫瘤的干系，而一些次要克隆則構成旁系。干系和旁系的基因型和表型可能存在差異，甚至在染色體層面也存在差別，這就為腫瘤臨床表現(xiàn)和治療反應性的差異打下了基礎，并且存在高度的復雜性。而腫瘤干細胞假說則認為在腫瘤中存在一小群干細胞樣細胞，這群細胞具有無限增殖和多向分化的潛能，因此在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，為適應腫瘤微環(huán)境的改變，由干細胞分化產生了多種不同的差異細胞，而這些差異細胞就是腫瘤異質性的來源。在該研究中，通過有限稀釋法獲得的單個A549細胞并非均能重新生長形成克隆，其中70%的細胞死亡，只有6個細胞最終生長為克隆，該結果提示在A549細胞中存在部分具有自我更新能力的細胞。另在已分離且擴大培養(yǎng)的單克隆細胞中存在兩種形態(tài)差異明顯的細胞克隆，其中以緊密型克隆為主。多項研究表明[6,7]，在不同的細胞株中分離的單克隆細胞可有三種類型，包括Holoclones、Paraclones和Meroclones，其中Meroclones是Holoclones和Paraclones的混合體，同時不同的克隆其克隆形態(tài)特征存在明顯差異，Holoclones因其具有生長快且具自我更新能力的特征被認為是具有干細胞特性的一類克隆。在該研究中，緊密型克隆其生長能力普遍強于散在型克隆，故應屬于文獻中的Holoclones類型，與相關文獻報道相符。但緊密型克隆的比例可達到66.7%，較文獻報道偏高，分析其原因為顯微鏡下人為依據大體形態(tài)區(qū)分克隆類型其準確率較低，但此類劃分可為后續(xù)研究提供有用的線索。

對于肺癌來說，EGFR基因突變是一種重要的驅動基因改變，其與TKI類靶向藥物的療效取得密切相關。該研究以EGFR基因突變?yōu)閷ο?，分析了A549細胞及其各子克隆細胞的EGFR基因突變狀態(tài)，均未發(fā)現(xiàn)存在EGFR基因突變的情況。提示A549細胞是一種TKI耐藥的肺癌細胞，在此類耐藥細胞中未發(fā)現(xiàn)存在EGFR基因突變的提示對TKI敏感的微克隆。

相關研究顯示[8]，腫瘤細胞的遺傳不穩(wěn)定性和腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤異質性的兩種主要因素，同時各種不同的腫瘤細胞克隆間又呈現(xiàn)一種競爭與協(xié)同的相對穩(wěn)態(tài)。當腫瘤微環(huán)境出現(xiàn)變化時(如使用藥物治療)，則具有不同相對穩(wěn)態(tài)的腫瘤細胞群體對于微環(huán)境的改變其反應性也存在差異，同時當微環(huán)境改變一段時間以后，不同于之前的新的腫瘤克隆穩(wěn)態(tài)又可能重新形成[9]。因此腫瘤細胞的異質性差異還可能與腫瘤的藥物治療反應性及耐藥機制相關。在該研究中，雖未直接進行A549細胞及其各子克隆細胞的耐藥性分析，但各子克隆細胞間生長能力的明顯差異也提示可能存在其對不同藥物反應性的差異。

綜上所述，A549細胞在細胞克隆形態(tài)以及生長特性等表型方面存在異質性。

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(本文編輯：鄭 穎)

Heterogeneity of human non-small cell lung cancer cell line A549

ShiXingyuan*,AiLiangmei,HuangWenjin,NieHao,YuHongwei,CaiLongmei,ZhouTongchong，F(xiàn)uWenfan

(FourthDepartmentofRadiationOncology,TumorHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510095,China)

*Correspondingauthor:Email：18549183@qq.com

Objective:To analyze the heterogeneity of lung cancer cell line A549. Methods: Limiting dilution was used to isolate the single clones of A549 cells and expanded for culture. Then, the growth and metastasis of the parental and offspring cells were analyzed to determine the heterogeneity of A549 cells. Results:Six sub-cell lines were isolated. There were significant differences in the proliferation and metastasis between the parental and offspring cells. Conclusion:A549 cells show heterogeneity of cell proliferation and metastasis, and the heterogeneity may be related to tumor metastasis.

non-small cell lung cancer; tumor heterogeneity

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.06.001

廣州市醫(yī)藥科技項目(20142A011023)

R734.2

A

2095-9664(2016)06-0001-03

2016-10-27)

*通訊作者：Email：18549183@qq.com