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    用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)4種刺激劑類禁用物質(zhì)

    2016-06-24 12:20:35丁晶琳董穎張麗娟趙君馬艷華閆寬
    關(guān)鍵詞:刺激劑興奮劑精密度

    丁晶琳 董穎 張麗娟 趙君 馬艷華 閆寬

    1國(guó)家體育總局反興奮劑中心(北京 100029)

    2北京化工大學(xué)理學(xué)院(北京 100029)

    用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)4種刺激劑類禁用物質(zhì)

    丁晶琳2董穎1張麗娟2趙君2馬艷華1閆寬1

    1國(guó)家體育總局反興奮劑中心(北京 100029)

    2北京化工大學(xué)理學(xué)院(北京 100029)

    目的:使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),為世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(WADA)在檢測(cè)窗口中擬增加的4種刺激劑甲磺美嗪(amezinium methylsulfate,I)、嗎拉宗(morazone,II)、貝美格(3-ethyl-3-methylglu?tarimide,III)和阿拉明(metaraminol,IV)建立了常規(guī)檢測(cè)方法,并對(duì)方法進(jìn)行考察和驗(yàn)證。方法:用5%的醋酸鉛水溶液將樣品中蛋白質(zhì)等大分子沉淀后,離心10分鐘,取上清液上機(jī)檢測(cè)。質(zhì)譜采用電噴霧電離源(ESI),在正離子模式下,通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)樣品進(jìn)行分析。結(jié)果:經(jīng)過(guò)定性和定量分析,得到上述四種刺激劑的檢測(cè)限(LOD)分別為0.1、0.5、5和0.5 ng/mL;定量限(LOQ)分別為0.3,1.5,15和1.5 ng/ mL;線性范圍(r2>0.99)分別在0.3~5000、1.5~3000、15~3000和1.5~4500 ng/mL之間。每種刺激劑在低、中和高3個(gè)濃度范圍的基質(zhì)效應(yīng)均在98%~120%之間;準(zhǔn)確度誤差在9%以內(nèi);日內(nèi)精密度的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于7.7%,日間精密度的標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)10%。結(jié)論:本研究建立的檢測(cè)方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度好和基質(zhì)干擾較小等特點(diǎn),滿足興奮劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的要求,并已經(jīng)應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè)中。

    液相色譜--串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用;刺激劑;方法驗(yàn)證;興奮劑控制

    刺激劑包含能夠增加刺激性、暫時(shí)緩解疲勞以及可能增強(qiáng)競(jìng)技性、攻擊性等生理作用的各類物質(zhì),如以苯丙胺為代表的中樞神經(jīng)刺激劑,以麻黃堿為代表的末梢交感神經(jīng)刺激劑等。刺激劑是競(jìng)技體育中濫用歷史最長(zhǎng)的興奮劑。刺激劑作用于中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng),可使運(yùn)動(dòng)員的行為和能力得到較快調(diào)整。刺激劑還可以提高肌肉的工作效率,減緩或加速消除疲勞,使運(yùn)動(dòng)員能夠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間和大強(qiáng)度的訓(xùn)練。但使用刺激劑類藥物的副作用也是顯而易見(jiàn)的,此類藥物會(huì)降低使用者的身體感知能力,削弱部分人體的自我保護(hù)功能。服用后,人體亢奮狀態(tài)持續(xù)一段時(shí)間后會(huì)進(jìn)入極度疲勞狀態(tài)。服用大劑量的刺激劑更會(huì)影響心肺功能,使人體器官超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn),造成器官損傷,嚴(yán)重者會(huì)引起血壓急劇上升和心律不齊等,更有甚者會(huì)導(dǎo)致死亡。

    氣相色譜-氮磷檢測(cè)(GC-NPD)技術(shù)是刺激劑傳統(tǒng)的檢測(cè)方法[1-4],但該方法具有檢測(cè)重現(xiàn)性較差和靈敏度低等缺點(diǎn)。也可將刺激劑衍生化后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)進(jìn)行檢測(cè)[5],但該方法的前處理繁瑣,所用衍生化試劑毒性大,干擾因素多且方法穩(wěn)定性差。為簡(jiǎn)化樣品前處理步驟,實(shí)現(xiàn)高通量、快速的檢測(cè)目標(biāo),文獻(xiàn)報(bào)道[6,7]將刺激劑在強(qiáng)堿性條件下用液液萃取的方法進(jìn)行提純后,用GC-MS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。為提高檢測(cè)靈敏度,近年來(lái)通常采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)檢測(cè)刺激劑[8-11]和其他禁用物質(zhì)[12-17]。

    圖1 本研究4種刺激劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

    世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(WADA)曾經(jīng)于2015年初向各個(gè)WADA認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室發(fā)了一份列表,詢問(wèn)是否為列表上的刺激劑類禁用物質(zhì)建立了檢測(cè)方法。本研究包含的4種刺激劑甲磺美嗪、嗎拉宗、貝美格和阿拉明(圖1)也包含在此列表中。通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知[18],甲磺美嗪主要通過(guò)尿液排出體外,尿液中大概含56%-89%原形藥物。Shintani[19]和Kokot[20]報(bào)道用液相色譜法測(cè)定甲磺美嗪在血漿中的濃度,檢測(cè)限為2 ng/mL。Lho 等[21]發(fā)表過(guò)一篇文章,介紹了使用氣相色譜方法檢測(cè)兔尿和血漿中嗎拉宗含量的方法。1991年,Soto-Otero 等[22]曾在文章中介紹過(guò)使用液相色譜法測(cè)定兔子血清和腦組織中貝美格的濃度。還有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于阿拉明的液相色譜檢測(cè)方法的研究[23,24],而在2000年Hill等報(bào)道了使用ACPI源的HPLC-MS/MS方法檢測(cè)馬尿中該藥物的含量[25]。

    到目前為止,國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)表有關(guān)上述4種刺激劑分別或同時(shí)用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)的檢測(cè)方法。因此,為上述4種刺激劑建立靈敏度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與裝置

    1290/6470 Triple Quad LC-MS/MS來(lái)自美國(guó)安捷倫公司(Agilent Technology);氮吹儀購(gòu)自英國(guó)比比科技有限公司(Bibby Scientific Ltd);低速離心機(jī)購(gòu)自北京雷勃爾離心機(jī)有限公司;感量0.0001 g電子天平來(lái)自瑞士梅特勒-托利多公司(Mettler Toledo);超純水系統(tǒng)(Milli-Q Advantage A10)由美國(guó)密理博公司生產(chǎn)(Millipore);GENIE VORTEX-2渦旋混合器由美國(guó)科技工業(yè)公司制造(Scientific Industries)。

    1.2 主要材料與試劑

    甲磺美嗪和貝美格來(lái)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社;嗎拉宗從加拿大全資公司(Toronto Research Chemi?cals INC)購(gòu)得;阿拉明、內(nèi)標(biāo)倍可降(mefruside)和色譜純甲醇購(gòu)自西格瑪奧德里奇科技有限公司;色譜純甲酸、甲酸銨和乙腈來(lái)自美國(guó)迪馬公司;醋酸鉛(分析純)來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控樣品溶液的制備

    儲(chǔ)備溶液:稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解制備成濃度為1 mg/mL的溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液:將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至10 μg/mL。刺激劑質(zhì)控樣品溶液:在空白尿中用標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋制備低、中和高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品溶液。

    1.4 樣品前處理

    采用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)刺激劑的方式對(duì)尿樣進(jìn)行前處理:用1 mL可調(diào)式移液槍準(zhǔn)確移取1 mL尿樣于10 mL螺口試管中,再加入1 mL濃度為5%的醋酸鉛水溶液(其中含有濃度為200 ng/mL的內(nèi)標(biāo)),渦旋混勻,以4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘,倒出上清液,取10 μL進(jìn)樣分析。

    1.5 儀器條件

    1.5.1 色譜條件

    Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm);采用pH 3.5的甲酸銨緩沖液(A)和乙腈(B)流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫;流速:0.4 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣體積10 μL。梯度洗脫程序如下:

    (1)0.00 min:90%solvent A

    (2)5.00 min:90%solvent A

    (3)10.00 min:50%solvent A

    (4)15.00 min:10%solvent A

    (5)16.00 min:10%solvent A

    (6)色譜柱平衡時(shí)間:4 min

    1.5.2 質(zhì)譜條件

    用電噴霧離子源(ESI),采用正離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集數(shù)據(jù)。霧化氣:20 psi;毛細(xì)管電壓:3000 V,離子源溫度:330℃;干燥氣流速:10 L/ min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 樣品的前處理

    由于興奮劑檢測(cè)大多收集運(yùn)動(dòng)員尿樣,含有的內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多,所以通常需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理,以達(dá)到純化和濃縮樣品的目的。樣品前處理方案通常需要根據(jù)選定的檢測(cè)方法和藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和代謝方式確定。由于大部分刺激劑的代謝方式為原形代謝,所以比較常用的前處理方式為直接進(jìn)樣法。該方法操作簡(jiǎn)單、快捷,能最大程度地保留尿樣中的藥物,是較為理想的前處理手段。

    2.2 HPLC-MS/MS檢測(cè)方法的建立

    本研究用濃度為1 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)全掃描發(fā)現(xiàn),4種刺激劑在正離子模式下的靈敏度明顯優(yōu)于負(fù)離子。再依次對(duì)質(zhì)譜的加速電壓和碰撞電壓等進(jìn)行優(yōu)化,相關(guān)數(shù)據(jù)參見(jiàn)表1。

    表1 4種刺激劑的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

    2.3 方法驗(yàn)證

    根據(jù)WADA實(shí)驗(yàn)室國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)技術(shù)文件的要求,我們測(cè)定了4種刺激劑的檢測(cè)限、定量限和線性范圍,并驗(yàn)證了方法的日間和日內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)干擾效應(yīng)和方法的特異性等指標(biāo)。

    2.3.1 檢測(cè)限(LOD) 和定量限(LOQ)

    檢測(cè)限是指對(duì)某一特定的分析方法在給定的可靠程度內(nèi)可以從樣品中檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的最小濃度,通常指信噪比S/N≥3時(shí)被測(cè)藥物的濃度。定量限是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量,其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度,一般定義為信噪比S/N≥10時(shí)被測(cè)藥物的濃度。檢測(cè)限與定量限的測(cè)定需要先用一份尿樣初略估計(jì),然后在10份不同的空白尿中添加接近或高于估算濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定(表2)。與WADA技術(shù)文件[26]中規(guī)定的刺激劑檢測(cè)能力最低要求(100 ng/mL)相比,本方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出對(duì)興奮劑樣品的檢測(cè)要求。

    2.3.2 線性范圍

    線性范圍指某一方法的校準(zhǔn)曲線的直線部分所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)濃度變化范圍。自LOQ開(kāi)始向上配制系列濃度的樣品,根據(jù)上述1.4的描述處理并上機(jī)檢測(cè),測(cè)量直至曲線出現(xiàn)彎曲時(shí)的濃度,此時(shí)相關(guān)系數(shù)r2大于0.99。通過(guò)測(cè)定得知(表3),這4種刺激劑都具有很寬的定量線性范圍。

    表2 4種刺激劑的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)

    表3 4種刺激劑的線性范圍

    2.3.3 精密度和準(zhǔn)確度

    精密度指一組測(cè)定的數(shù)據(jù)之間的接近程度,數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定越接近,顯示其精密度越高。準(zhǔn)確度是指檢測(cè)值與真值之間的偏離程度。本實(shí)驗(yàn)的精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定是在低、中和高3個(gè)濃度級(jí)別進(jìn)行的。在10份空白尿中,分別添加上述3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,依據(jù)1.4的描述進(jìn)行前處理并上機(jī)檢測(cè),得出日內(nèi)精密度。按照日內(nèi)精密度的操作方法,每天操作1次,共做至少3次,計(jì)算得出日間精密度。通過(guò)工作曲線計(jì)算測(cè)量值,與真實(shí)值進(jìn)行比較再乘以百分比,即為準(zhǔn)確度(見(jiàn)表2)。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4種刺激劑在3個(gè)濃度水平下日內(nèi)變異系數(shù)均小于7.7%,日間變異系數(shù)均小于10%,檢測(cè)的準(zhǔn)確度偏差均低于8.2%,符合興奮劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)的要求。

    2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

    尿樣中的基質(zhì)常常對(duì)待測(cè)物的分析過(guò)程有顯著干擾,并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,稱之為基質(zhì)效應(yīng)。在10份不同的空白尿中分別添加低、中和高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研究。將空白尿按照上述1.4的描述進(jìn)行前處理后,在上清液中添加一定濃度的刺激劑和內(nèi)標(biāo),上機(jī)檢測(cè)得到峰面積B。同時(shí),將同體積的純水經(jīng)過(guò)前處理后,在上清液中添加相同濃度的刺激劑和內(nèi)標(biāo),上機(jī)檢測(cè)得到峰面積A?;|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算方式如下:

    基質(zhì)效應(yīng) =刺激劑峰面積B/內(nèi)標(biāo)峰面積B÷刺激劑峰面積A/內(nèi)標(biāo)峰面積A×100%

    表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,4種刺激劑在低、中和高3個(gè)濃度下的基質(zhì)效應(yīng)均在可接受范圍內(nèi)(98%~120%)。

    2.3.5 特異性

    特異性是指在樣品介質(zhì)中有其它組分共存時(shí),檢測(cè)方法對(duì)待測(cè)物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力。當(dāng)樣品中含有被分析物時(shí)呈陽(yáng)性反應(yīng),不含被分析物時(shí)呈陰性反應(yīng)。本研究選擇了50份空白尿樣,經(jīng)前處理并上機(jī)檢測(cè)后,發(fā)現(xiàn)尿樣中基質(zhì)對(duì)待測(cè)離子窗口無(wú)影響。

    3 總結(jié)

    本研究為WADA擬在檢測(cè)窗口中增加的4種刺激劑類禁用物質(zhì)建立了HPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)方法,并對(duì)方法進(jìn)行了全面考察和驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法不僅具有靈敏度高和線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn),還具有很好的精密度和準(zhǔn)確度,抗基質(zhì)干擾能力和特異性強(qiáng)也為該方法的實(shí)際應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。目前這4種刺激劑已經(jīng)添加到我們實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)窗口中。

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    [26]World Anti-Doping Agency:WADA Technical Document. http://www.wada-ama.org.

    The Developed LC-MS/MS Method for the Detection of Four Prohibited Stimulants

    Ding Jinglin2,Dong Ying1,Zhang Lijuan2,Zhao Jun2,Ma Yanhua1,Yan Kuan1
    1 National Anti-Doping Laboratory,China Anti-Doping Agency,Beijing 100029,China
    2 Faculty of Science,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China

    Dong Ying,Email:dongying@chinada.cn Zhang Lijuan,Email:dazlj@mail.buct.edu.cn

    ObjectiveTo develop and validate a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LCMS/MS)method for the detection of 4 stimulants including amezinium methylsulfate(I),morazone(II),3-ethyl-3-methylglutarimide(III)and metaraminol(IV)to be added to the detection window by World Antidoping Agency.MethodAn equal volume of 5%lead acetate aqueous solution was employed to pre?cipitate the proteins in urine samples.After centrifugation for 10 min,the supernatant was introduced directly into the LC-MS/MS system using positive electrospray ionization with multiple reaction monitor?ing(MRM)mode.ResultsThe limit of detections(LODs)for stimulants I-IV were 0.1,0.5,5 and 0.5 ng/ mL respectively,while the limit of quantifications(LOQs)were 0.3,1.5,15 and 1.5 ng/mL accordingly. The assays were linear(r2>0.99)over the concentration ranges of 0.3-5000,1.5-3000,15-3000 and 1.5-4500 ng/mL in human urine respectively.The established method also achieved satisfactory results in terms of intra-and inter-day precisions(CV<10%),accuracies(bias<9%),matrix effect(98-120%)and specificity at low,medium and high concentration levels.ConclusionsThe developed method is precise,sensitive and accurate with minimum sample preparation.It is a fit-for-purpose approach and has been applied in the National Anti-Doping Laboratory for doping-control sample analysis.

    LC-MS/MS,stimulants,method validation,doping control

    2016.4.19

    董穎,Email:dongying@chinada.cn;張麗娟,Email:dazlj@mail.buct.edu.cn

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