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    生物反應(yīng)器工藝生產(chǎn)水痘疫苗的可行性研究

    2016-05-14 19:32:34關(guān)瑜孫衛(wèi)華
    關(guān)鍵詞:水痘疫苗

    關(guān)瑜 孫衛(wèi)華

    摘 要:目的:研究生物反應(yīng)器培養(yǎng)人二倍體MRC-5細(xì)胞,并用來制備水痘疫苗的可行性。方法: 將MRC-5細(xì)胞接種1L生物反應(yīng)器,使用GE公司Cytodex 1 微載體,濃度為:3g/L,工作體積300ml,待細(xì)胞長滿單層后接種水痘病毒,當(dāng)細(xì)胞病變約達(dá)75%以上時結(jié)束培養(yǎng),收獲細(xì)胞培養(yǎng)物及培養(yǎng)液,-80℃快速凍融一次,過濾除去微載體及細(xì)胞碎片,收獲病毒懸液,測定水痘病毒滴度。結(jié)果: 細(xì)胞接種反應(yīng)器后,大約3小時貼壁完成,5小時后開始伸展為長梭形,3天后細(xì)胞長成致密單層,接種水痘病毒后大約48小時病變,72小時收獲。收獲后的病毒滴度檢測結(jié)果為120,000 PFU/mL。結(jié)論 :二倍體細(xì)胞可以在生物反應(yīng)器中正常生長,并且接種水痘病毒后產(chǎn)生病變,本試驗證明了應(yīng)用生物反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)二倍體細(xì)胞擴增水痘病毒,生產(chǎn)水痘疫苗的方法可行。

    關(guān)鍵詞:水痘;疫苗;生物反應(yīng)器

    中圖分類號: Q-3.2 文獻標(biāo)識碼: A 文章編號: 1673-1069(2016)15-195-2

    0 引言

    目前針對水痘和帶狀皰疹還沒有有效的治療方法,接種疫苗是預(yù)防水痘感染的唯一有效手段[1-2]。國外生產(chǎn)水痘疫苗采用細(xì)胞工廠工藝進行疫苗制造[3-4],而國內(nèi)生產(chǎn)水痘疫苗仍然采用傳統(tǒng)的克氏瓶或轉(zhuǎn)瓶工藝進行疫苗生產(chǎn)[5-6]。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有勞動強度大,占地空間大,單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小,細(xì)胞生長密度低,瓶間差異較難控制等缺點,越來越不適應(yīng)GMP和WHO認(rèn)證的要求。生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)在國外已有四十多年的應(yīng)用歷史,近十年來在中國開始逐漸普及[7]。由于其便捷安全的操作方式,可控性好,占用較少的空間等優(yōu)點,生物反應(yīng)器已被越來越多的國內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)所接受,如遼寧成大、廣州諾成等生物科技有限公司生產(chǎn)的凍干人用狂犬病疫苗和乙腦疫苗[8-9],另外國內(nèi)有些公司也逐漸開始研究微載體反應(yīng)器替代轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞工廠工藝生產(chǎn)甲肝疫苗、麻疹疫苗等產(chǎn)品[10]。本課題將生物反應(yīng)器工藝引入水痘疫苗的生產(chǎn)中研究其可行性,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株及毒株

    MRC-5細(xì)胞株來源:購買于ATCC;工作代細(xì)胞批號為:WCB20100901,代次為24代。

    水痘毒株Oka株來源:購買于ATCC;工作代毒種批號為:20120201 W,代次為47代。

    1.2 主要耗材

    175cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(CORNING);細(xì)胞工廠(CORNING);多道移液器、單道移液器(規(guī)格:20~200ul;100~1000 ul,Eppendorf);玻璃刻度吸管(規(guī)格:5mL,10mL等); 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING);Cytodex 1 微載體(GE公司)。

    1.3 主要設(shè)備

    荷蘭Applikon生物反應(yīng)器;天津泰特儀器設(shè)備有限公司 電熱恒溫水浴箱;Thermo生物安全柜;三洋37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱;OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡。

    1.4 微載體培養(yǎng)方法

    將MRC-5細(xì)胞接種1L生物反應(yīng)器,待細(xì)胞長滿單層后接種水痘病毒,具體步驟如下:

    復(fù)蘇24代MRC-5細(xì)胞,至T175細(xì)胞瓶中,按1:2比例傳代3次至8瓶,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為成纖維細(xì)胞形態(tài),呈梭形,細(xì)胞排列致密無空隙,準(zhǔn)備用于生物反應(yīng)器培養(yǎng)。

    反應(yīng)器用二甲基二氯硅烷硅化處理,微載體經(jīng)PBS溶脹并清洗處理后加入反應(yīng)器中,高壓濕熱滅菌反應(yīng)器及微載體,準(zhǔn)備培養(yǎng)細(xì)胞。(微載體使用量3g/L ,培養(yǎng)體積300mL,按培養(yǎng)面積比1:2上罐傳代)

    用0.25%胰酶消化8瓶長滿單層T175細(xì)胞后,加入預(yù)熱的細(xì)胞生長液吹打均勻,接種至1L反應(yīng)器中,使用體積為300mL。將1L反應(yīng)器控制設(shè)定溫度:37℃;pH值:7.2;溶氧值:40%;調(diào)整適當(dāng)攪拌速度,以微載體混勻且不沉淀的最小攪拌速度為最佳。每天換液300mL,同時取樣觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。待微載體表面的細(xì)胞長滿均一單層時接種水痘病毒,設(shè)定溫度:35℃;pH值:7.3;溶氧值:35%;觀察細(xì)胞病變情況,待細(xì)胞病變約達(dá)75%以上時結(jié)束培養(yǎng),收獲細(xì)胞培養(yǎng)物及培養(yǎng)液,-80℃快速凍融一次,過濾除去微載體及細(xì)胞碎片,收獲病毒懸液,測定水痘原液病毒滴度。

    1.5 檢驗方法

    測定病毒滴度是用蝕斑試驗的方法,取人二倍體細(xì)胞MRC-5,以pH7.2、含10%小牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基接種6孔板,每孔加密度為1×105個/mL的MRC-5細(xì)胞懸液3mL,置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~4天,待MRC-5細(xì)胞形成均勻、致密的細(xì)胞單層后,棄去原有的生長液。用含3%小牛血清、5%蔗糖和1%谷氨酸鈉的PBS緩沖液將待檢品做10倍系列稀釋,一般取10-2~10-5稀釋度的樣品接種6孔板,每稀釋度接種2孔,置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附60分鐘,期間每20分鐘輕輕振搖一次。吸附完畢補加pH 7.4、含3%小牛血清的MEM培養(yǎng)基維持液,3m1/孔,置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。培養(yǎng)到期后,棄去原生長液,每孔加1~2mL 0.25%的考馬斯亮藍(lán)染液,染色5~10分鐘,棄去考馬斯亮藍(lán)染色液,將六孔板用PBS沖洗干凈,在閱片燈燈光背景下點數(shù)空斑個數(shù),計算病毒滴度,計算方法如下:

    空斑個數(shù)×稀釋倍數(shù)×10= PFU/mL,即為待檢樣品的滴度。

    2 結(jié)果

    在顯微鏡下觀察到細(xì)胞接種反應(yīng)器后,細(xì)胞懸液中游離細(xì)胞逐漸減少,大約3小時貼壁完成。5小時后開始伸展為長梭形,每天換液300ml,大約3天后細(xì)胞長成致密單層,接種水痘病毒后大約48小時發(fā)現(xiàn)病變,72小時病變達(dá)到75%,收獲水痘病毒原液。

    2.1 細(xì)胞接種反應(yīng)器后的生長狀況

    2.2 收獲液病毒滴度

    收獲后的水痘原液病毒滴度檢測結(jié)果為120,000 PFU/mL。

    3 討論

    人二倍體細(xì)胞作為病毒培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞,最重要的優(yōu)點是安全性強,無內(nèi)外源病毒因子感染,而且已證明無致癌性,但二倍體細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)條件下難以生產(chǎn)獲得高滴度的病毒,因此如何使用人二倍體細(xì)胞獲得高滴度水痘疫苗,成為近年來的研究重點。而生物反應(yīng)器條件下培養(yǎng)不但可以增加細(xì)胞的密度與數(shù)量,且可通過主動通氣加強氣體交換,穩(wěn)定的控制溫度溶氧pH等參數(shù),創(chuàng)造利于細(xì)胞生長和病毒繁殖的環(huán)境,易獲得高滴度的病毒原液,生產(chǎn)高品質(zhì)疫苗原液。

    通過本試驗發(fā)現(xiàn)二倍體細(xì)胞在反應(yīng)器中長勢良好,接種病毒后產(chǎn)生正常病變,且滴度較高,本試驗初步證明反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)二倍體細(xì)胞,擴增水痘病毒,生產(chǎn)水痘疫苗的方法可行。該方法的工藝參數(shù)及疫苗產(chǎn)量還有待進一步深入的進行研究。

    參 考 文 獻

    [1] (美)普洛特金(Plotkin,S.),著.疫苗學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社,2011.999-1049.

    [2] 張延齡,張暉主編.疫苗學(xué)[M].科學(xué)出版社,2004.

    [3] 劉曄,李生軍,李春明.凍干水痘減毒活疫苗轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝的建立[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2014,32(1):9-12.

    [4] 王斐,單雪峰等.水痘減毒活疫苗生產(chǎn)工藝研究[J].中國新藥雜志疫苗???012,10:1174-1177.

    [5] 王佃亮,韓梅勝.動物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器及相關(guān)技術(shù)[J].中國生物工程雜志,2013,23:23-27.

    [6] 王樹君,代長海等.用為載體系統(tǒng)培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)高滴度狂犬病毒液[J].中國生物制品學(xué)雜志.2004(06):45-47.

    [7] 查力,高軍等.生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)制備人用狂犬病疫苗[J].中國生物制品學(xué)雜志,2006,19(3):288-290.

    [8] 劉景曄,劉令九,屈翠波,王擁軍,孫妹,吳曉娟,梁曉莉,王瑋,王鵬富.采用一批細(xì)胞基質(zhì)同時收獲甲肝和麻疹病毒[J].中國生物制品學(xué)雜志,2002(04).

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