DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中的一些技巧

倪瑩瑩

高中生物新課程選修（1）專題（5）DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)中有DNA的粗提取與鑒定這個(gè)實(shí)驗(yàn)，在做這個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，好多老師都認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)繁瑣、復(fù)雜，做不做無(wú)所謂，有的用光盤給學(xué)生看一下實(shí)驗(yàn)過(guò)程或簡(jiǎn)單講一下就算過(guò)去了.我卻不這樣認(rèn)為，我覺得這個(gè)實(shí)驗(yàn)一定要讓學(xué)生做，而且必須認(rèn)認(rèn)真真踏踏實(shí)實(shí)地做，只有通過(guò)做這個(gè)實(shí)驗(yàn)學(xué)生才能明白，了解課堂上老師所講生物的遺傳物質(zhì)究竟是怎樣一種物質(zhì)，具有什么特點(diǎn)等.

一、實(shí)驗(yàn)前相關(guān)溶液的配備

1.雞血細(xì)胞液的配制：取質(zhì)量濃度為0，1 g/mL的檸檬酸鈉溶液（抗凝劑）100 mL，置于500 mL燒杯中.將宰殺活雞流出的雞血（約180 mL）注入燒杯中，同時(shí)用玻棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免凝血.此實(shí)驗(yàn)，由于班級(jí)較多，需要的雞血細(xì)胞液量大，可將配好的檸檬酸鈉溶液放在塑料桶中，帶到宰雞場(chǎng)等血，再由于每只雞血量不等，而且宰雞場(chǎng)殺雞的速度快，因此檸檬酸鈉溶液與雞血的比例可由原來(lái)的100∶180提升到1∶1，用一只500 mL的塑料燒杯（注：盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器.雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少.因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過(guò)程中DNA的損失.）按1∶1快速采集雞血，注意的是要先加抗凝劑，再加雞血，而且一定要攪拌.采集好的雞血然后集中到一個(gè)大的塑料桶中.回到學(xué)校，再分放在幾個(gè)的塑料燒杯中，放入冰箱內(nèi)靜置一天，使血細(xì)胞自行沉淀，然后倒去上清液，即可得到所需的雞血細(xì)胞液.（一般不用離心機(jī)，一方面離心機(jī)對(duì)離心管所裝血液質(zhì)量要求較高，另一方面由于當(dāng)天采血當(dāng)天做實(shí)驗(yàn)的班級(jí)較多，時(shí)間較為倉(cāng)促）.

（2） 95%酒精溶液的配制（在實(shí)驗(yàn)前放入冰箱內(nèi)冷卻24小時(shí)）

（3）氯化鈉的物質(zhì)的量的濃度分別為2 mol/L和0.015 mol/L的溶液

（4）二苯胺試劑的配制：1克二苯胺加入100 mL冰醋酸+2.75 mL濃H2SO4，放在冰箱內(nèi)，可視班級(jí)多少酌量配制.

二、與學(xué)生共同探討清楚，該實(shí)驗(yàn)原理

1.DNA高鹽中溶解，低鹽中析出：DNA在氯化鈉溶液中的溶解度，是隨著氯化鈉的濃度的變化而改變的.當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L，DNA的溶解度最低.利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中的DNA析出.

2.用酒精去除雜質(zhì)，而得到較純的DNA：DNA不溶于酒清溶液，但是細(xì)胞中某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液.利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA.

3.二苯胺顯色鑒定DNA：DNA遇二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此， 二苯胺可以用為鑒定DNA的試劑.

三、正確理解各實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)及原理

1.低滲攪拌破碎血細(xì)胞，釋放DNA：將制備好的雞血細(xì)胞液5 mL～10 mL，注入到50 mL燒杯中.向燒杯中加入蒸餾水20 mL，同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢? min，使血細(xì)胞加速破裂.（注：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)，是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞破裂，同時(shí)，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂，即細(xì)胞膜和核膜的破裂，于是釋放出DNA.）然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過(guò)濾至500 mL的燒杯中，取其濾液.

2.高鹽溶解DNA：將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的溶液40 mL加入到濾液中，用玻棒沿一個(gè)方向攪拌1 min，使其混合均勻，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài).

3.低鹽DNA析出：沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物（DNA）出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色.繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來(lái)越多.當(dāng)加入的蒸餾水使氯化鈉的濃度達(dá)到DNA的溶解度的最低點(diǎn)0.14 mol/L，粘稠物不再增加，這時(shí)停止加入蒸餾水，（注入蒸餾水約300 mL左右）

4.濾出DNA，DNA高鹽再溶解，再過(guò)濾：用多層紗布過(guò)濾，使DNA的粘稠物留在紗布上，取一個(gè)50 mL的燒杯，向燒杯內(nèi)注入物質(zhì)的量為2 mol/L的氯化鈉溶液20 mL，用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，（注：如果粘稠物不容易取，可將有粘稠物的紗布面反過(guò)來(lái)浸在2 mol/L的氯化鈉溶液中，用鑷子輕輕地拔下粘稠物，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中.）

5.冷卻酒精漂洗，DNA析出：在上述濾過(guò)的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為95%的溶液50 mL（使用冷卻的酒精，對(duì)DNA的凝集效果較佳），并用玻棒攪拌，溶液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物.用玻棒將絲狀物卷起，（玻棒對(duì)DNA有吸附作用）并用濾紙吸取上面的水分.這種絲狀物的主要成分就是DNA.注意觀察絲狀物是什么顏色的.

6.DNA顯色鑒定：取兩支20 mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量溶液為0.015 mol/L的溶液5 mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解.（如果絲狀物不溶解，可直接將纏有絲狀物的玻棒放在試管中）然后，向兩支試管中各加4 mL的二苯胺試劑.混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5 min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化.

四、實(shí)驗(yàn)注意

1.低滲破碎要徹底，攪拌只能朝一個(gè)方向，攪拌要快.

2.過(guò)濾要細(xì)致，由于血液粘稠度高，不易過(guò)濾.可將紗布四周攏起，用玻棒輕輕的按.

3.低鹽DNA析出，加入蒸餾水?dāng)嚢枰?

該實(shí)驗(yàn)一般需要兩節(jié)課時(shí)間，學(xué)生一邊實(shí)驗(yàn)，一邊思考（整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程融會(huì)貫通，不能機(jī)械地跟著步驟走），有些同學(xué)在實(shí)驗(yàn)中會(huì)因?yàn)槟承┰蚨。處熞膭?lì)他們?cè)僭囈槐?，找出原?讓他們面對(duì)失敗不急不躁，沉著耐心，反復(fù)操作.當(dāng)DNA和二苯胺在沸水中溶液顏色逐漸變藍(lán)，即是學(xué)生享受成功喜悅之時(shí).