懷地黃中地黃苷D的提取工藝及不同炮制品含量的比較研究

張彩 張萍 司文琪 趙燕 史磊

摘 要：為建立懷地黃中地黃苷D的提取工藝，并比較不同炮制品中地黃苷D的含量，采用單因素實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選懷地黃中地黃苷D的提取工藝；采用高效液相色譜法測定懷地黃不同炮制品中地黃苷D的含量。結(jié)果表明： 懷地黃中地黃苷D的最佳提取工藝條件為60%甲醇加熱回流提取2 h，該工藝穩(wěn)定可行，地黃苷D提取率較高；生地黃中地黃苷D的含量為0.250%，比熟地黃（0.208%）高。

關(guān)鍵詞：懷地黃；地黃苷D；高效液相色譜

中圖分類號：S567.23文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）05-0127-04

Abstract To establish the extraction process of rehmannioside D in Radx Rehmanniae， and compare its content in different processed products， the single factor experiments were conducted to optimize the extraction process， and the HPLC method was adopted to detect the rehmannioside D content. The results showed that the optimal extraction conditions were heating reflux extraction for 2 hours with 60% of methanol， which was stable and reliable with higher extraction rate. The content of rehmannioside D in Radix Rehmanniae was 0.250%， which was higher than that in Radix Rehmanniae Praeparata （0.208%）.

Key words Radix Rehmanniae； Rehmannioside D； High performance liquid chromatography （HPLC）

地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch） 的新鮮或干燥塊根。主產(chǎn)于河南焦作地區(qū)溫縣、武陟（古懷慶府） 等地的道地藥材稱為懷地黃[1]，現(xiàn)代研究表明其品質(zhì)優(yōu)于其他地黃[2，3]。生地黃能夠清熱涼血、養(yǎng)陰生津， 熟地黃具有滋陰補(bǔ)血， 益精填髓的功效[4] 。關(guān)于地黃的化學(xué)成分已有大量研究[ 5，6]。地黃苷D為地黃的主要有效成分，且炮制前后其含量相對穩(wěn)定，在生地黃、熟地黃中含量均較高[7]，故測定其含量對考察地黃藥材質(zhì)量具有一定意義。

本試驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選懷地黃中地黃苷D的提取工藝，用高效液相色譜法對懷地黃不同炮制品中主要有效成分地黃苷D進(jìn)行了含量測定，比較不同加工炮制方法對其含量的影響，為懷地黃中地黃苷D的高效提取及合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生地黃，經(jīng)鑒定來源為Rehmannia glutinosa Libosch的塊根。

1.2 試劑

甲醇（分析純），純凈水，乙腈（色譜純），地黃苷D標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，CAS號：81720-08-3）。

1.3 儀器

高效液相色譜分析儀（安捷倫1200型），KQ-500E型超聲波清洗器，BSA224賽多利斯電子天平，101-0A型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱，DLSB-ZC型低溫循環(huán)（真空）泵，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，高速萬能粉碎機(jī)QE-300克，HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，KDM型調(diào)溫電熱套，SHANGHAI濾膜（0.45 μm）。

1.4 樣品的制備

1.4.1 生地黃 取道地生地黃，烘干至八成干，切丁，60℃恒溫干燥12 h，粉碎，過4號篩。

1.4.2 熟地黃 取凈生地黃，置籠屜內(nèi)蒸至內(nèi)外黑潤，取出，曬至八成干，切丁，60℃恒溫干燥12 h，粉碎，過4號篩。

1.5 供試品溶液的制備

精密稱取約1.0 g生地黃粗粉，置500 mL圓底燒瓶中，加入60%甲醇溶液100 mL，加熱回流提取2 h，冷卻，補(bǔ)足失重，抽濾，精密量取抽濾液10 mL，90℃水浴濃縮至近干，濃縮物用10%乙腈溶液溶解，定容至50 mL。0.45 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取地黃苷D標(biāo)準(zhǔn)品，10%乙腈溶解，定容至50 mL，得0.088 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.7 色譜條件

色譜柱Aglient TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（4∶96）；流速1.0 mL/min；檢測波長205 nm；柱溫25℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素法優(yōu)選懷地黃地黃苷D提取工藝

2.1.1 提取溶劑的考察 精密稱取生地黃粗粉4份，各約1.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，分別加入50%、60%、70%、80%甲醇溶液100 mL，按1.5方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測地黃苷D峰面積。經(jīng)考察選擇60%甲醇溶液作為提取溶劑（表1）。

2.1.2 提取方法的考察 精密稱取生地黃粗粉2份，各約1.0 g，置于500 mL圓底燒瓶和具塞錐形瓶中，60%甲醇溶液作為提取溶劑，分別采用加熱回流2 h、50℃超聲30 min的方法提取，測地黃苷D峰面積。經(jīng)考察選擇加熱回流的提取方法（表2）。

2.1.3 提取時間的考察 精密稱取生地黃粗粉3份，各約1.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，60%甲醇溶液作為提取溶劑，加熱回流提取1.5、2.0、2.5 h，測地黃苷D峰面積。經(jīng)考察選擇加熱回流提取時間為2 h（表3）。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，用10%乙腈定容至10 mL，制成系列對照品溶液。分別進(jìn)樣20 μL，以峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品含量（mg/mL）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y=1.371×10-5X-2.546×10-4，在0.00088～0.0176 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積RSD=1.27%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取生地黃粗粉約1.0 g，按照1.5方法配制供試品溶液，在配置后0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20 μL，計算得RSD=1.6%，表明生地黃供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取生地黃粗粉5份，各約1.0 g，按1.5方法配制供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，計算得RSD=1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知地黃苷D含量的生地黃粗粉，各約1.0 g，分別精密加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按供試品溶液制備方法進(jìn)行提取，以1.7色譜條件進(jìn)行測定，測得地黃苷D的平均回收率為99.4%，RSD=2.0%（表4）。

2.3 懷地黃不同炮制品中地黃苷D的含量測定

準(zhǔn)確量取生地黃、熟地黃供試品溶液，以1.7色譜條件進(jìn)行測定，記錄生地黃及熟地黃中地黃苷D的峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中地黃苷D 的含量。見表5和圖1～3。

3 結(jié)論與討論

地黃苷D是地黃主要有效成分和特征成分之一。有文獻(xiàn)報道，用80%甲醇加熱回流2 h地黃苷D的提取率較高、雜質(zhì)較少[8]；60%甲醇超聲提取，提取率較高，且提取時間較短[9]。研究用單因素法對提取溶劑、方法和時間進(jìn)行考察，結(jié)果表明以60%甲醇加熱回流2 h 提取效率較高，且操作簡便。

本試驗(yàn)將生地黃、熟地黃預(yù)先干燥，排除了不同炮制品由于含水量不同而造成的地黃苷D含量差異。經(jīng)高效液相測定，生地黃、熟地黃中地黃苷D的含量分別為0.250%、0.208%，表明炮制前后，其含量相對穩(wěn)定。這與李更生等[10]用高效液相測得的生、熟地黃中地黃苷D含量變化較大的結(jié)論有所差別，原因可能是采收和炮制方法不同，因《中國藥典》2010 年版（一部） 熟地黃的制作方法中，并未明確時間、溫度等參數(shù)；另外也與研究的地黃品種和產(chǎn)地不同有關(guān)。但此結(jié)論缺乏理論支持，有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 王太霞.懷地黃塊根的發(fā)育與有效成分的積累關(guān)系及其道地性形成機(jī)制的研究[D].西安：西北大學(xué)，2004.

[2] 都恒青，李趙曦，劉根成.地黃的質(zhì)量研究[J].中國中藥雜志，1992，17（6）：327-329.

[3] 張留記，屠萬倩.懷地黃品種比較和質(zhì)量研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（3）：101-102.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：115-117.

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[6] 邊寶林，王宏潔，沈欣，等.鮮地黃及不同干燥條件下的生地黃中麥角甾苷的含量測定[J].中成藥， 1997， 19（8）：20-21.

[7] 岳超，高杰，石上梅，等.HPLC 測定地黃炮制前后3種苷類物質(zhì)的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（4）：71-74.

[8] 李更生，王慧森. HPLC 法測定地黃中地黃苷D 含量[J]. 中草藥，2003，34（8）：752-754.

[9] 劉炯，張杰，張華鋒，等. HPLC 測定不同品種懷地黃中地黃苷A、D的含量[J]. 藥物分析雜志，2014，34（2）：335-339.

[10]李更生，劉明，王慧森，等.生地黃與熟地黃中地黃苷A、D的比較分析[J]. 中成藥，2008，30（1）：93-96.