棕櫚薊馬對(duì)番茄斑萎病毒的傳毒特征及其在日光溫室的發(fā)生關(guān)系研究

張安盛 毛曉紅 于毅 周仙紅 莊乾營(yíng)

摘 要：通過(guò)室內(nèi)PCR檢測(cè)和日光溫室定點(diǎn)調(diào)查，研究了棕櫚薊馬對(duì)番茄斑萎病毒的傳毒特征、番茄斑萎病毒病發(fā)生與棕櫚薊馬種群動(dòng)態(tài)的關(guān)系。結(jié)果表明，用帶毒菜椒植株飼喂健康棕櫚薊馬若蟲(chóng)24～96 h，棕櫚薊馬帶毒率達(dá)15.00%～18.33%，帶毒棕櫚薊馬成蟲(chóng)取食健康菜椒植株12～48 h，其理論傳毒效率可達(dá)36.37%～59.10%，表明棕櫚薊馬若蟲(chóng)具有一定獲毒能力，其成蟲(chóng)具有一定傳毒能力； 4月下旬之前，棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量較低，病毒病沒(méi)有發(fā)生；4月下旬～5月中旬，棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量略有提高，病毒病開(kāi)始出現(xiàn)，但菜椒植株帶毒率較低；5月下旬～6月初，棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量增長(zhǎng)迅速，菜椒植株帶毒率亦呈快速增長(zhǎng)狀態(tài)，表明菜椒植株帶毒率與棕櫚薊馬成蟲(chóng)密度密切相關(guān)，且病毒病的發(fā)生具有一定滯后性。

關(guān)鍵詞：棕櫚薊馬；番茄斑萎病毒；傳毒特征；發(fā)生關(guān)系

中圖分類號(hào)：S436.412.2+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）05-0098-04

Abstract The transmission characteristics of Tomato spotted wilt virus （TSWV） by Thrips palmi and the relationship between the occurrence of TSWV and the population dynamics of T. palmi were studied by point-survey in solar greenhouse and PCR detection in the lab. The results showed that the virus carrying rate of T. palmi was 15.00%～18.33% when the healthy T. palmi nymphs were fed on viruliferous sweet pepper plants for 24～96 hours，and the theoretical virus transmission efficiency of T. palmi adults were 36.37%～59.10% when the viruliferous T. palmi adults were fed on healthy sweet pepper plants for 12～48 hours， which indicated that the T. palmi nymphs had certain virus acquisition ability and the adults had certain virus transmission ability. The number of T. palmi adults was low and the TSWV had not occurred before the last ten days of April. The number of T. palmi adults increased slowly and the TSWV appeared but the viruliferous percentage of sweet pepper plant was low from the last ten days of April to the middle ten days of May. The number of T. palmi adults increased rapidly and the viruliferous percentage of sweet pepper plant enhanced rapidly as well from the last ten days of May to the earlier ten days of June. Therefore， the viruliferous percentage of sweet pepper plant was closely related to the population density of T. palmi adults and the occurrence of TSWV lagged behind the the appearance of T. palmi adults.

Key words Thrips palmi； Tomato spotted wilt virus； Transmission characteristics； Occurrence relationship

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），可侵染蔬菜、花生、大豆等多種農(nóng)作物，是世界十大危險(xiǎn)性植物病毒之一[1]。番茄斑萎病毒病1915年在澳洲被首次發(fā)現(xiàn)，而后在歐洲、美洲和非洲等地暴發(fā)，造成辣椒、番茄等蔬菜重大損失，甚至絕產(chǎn)[2]。在我國(guó)，番茄斑萎病毒最早于1984年在廣州花生植株上被發(fā)現(xiàn)[3]，而后在四川煙草上被報(bào)道[4]。自2000年起，該病毒病在云南省大面積危害，對(duì)該地區(qū)菜椒、番茄、煙草、花卉等作物生產(chǎn)造成重大損失[5～8]。2012年，番茄斑萎病毒病在北京市海淀區(qū)日光溫室辣椒上發(fā)生[9]，2014～2015年課題組在山東省濟(jì)南等地菜椒植株上發(fā)現(xiàn)疑似病株。

番茄斑萎病毒傳毒介體是薊馬[10]，薊馬若蟲(chóng)期獲毒，病毒在薊馬體內(nèi)復(fù)制，成蟲(chóng)期將病毒傳播到寄主植物[11]。棕櫚薊馬（Thrips palmi）是番茄斑萎病毒重要的傳毒介體，也是我國(guó)北方設(shè)施蔬菜薊馬類害蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種，其發(fā)生區(qū)域、種群數(shù)量、危害程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于花薊馬、煙薊馬和西花薊馬等其它薊馬類害蟲(chóng)。番茄斑萎病毒病已經(jīng)在我國(guó)北方設(shè)施蔬菜上發(fā)生，其傳播蔓延速度和危害程度，與棕櫚薊馬的發(fā)生為害和傳毒特征密切相關(guān)。本研究初步測(cè)定了棕櫚薊馬對(duì)番茄斑萎病毒的傳毒特征，調(diào)查了日光溫室條件下番茄斑萎病毒病發(fā)生與棕櫚薊馬種群動(dòng)態(tài)的關(guān)系，以期為番茄斑萎病毒病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 RXZ-280D-LED光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠產(chǎn)）； TP600PCR儀（TaKaRa公司產(chǎn)）；凝膠成像儀（Alpha Innotech公司產(chǎn)）； DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠產(chǎn)）；5804R低溫冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司產(chǎn)）； MDF-U4086S -80℃冰箱（SANYO公司產(chǎn)）；MLS-3020高壓滅菌鍋（SANYO公司產(chǎn)）； SHZ-82型水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)醫(yī)療器械廠產(chǎn)）；2.5～1 000 μL移液器（Eppendorf公司產(chǎn)）；120目防蟲(chóng)網(wǎng)（浙江省臺(tái)州市路橋區(qū)德農(nóng)防蟲(chóng)網(wǎng)廠生產(chǎn)）；養(yǎng)蟲(chóng)瓶（高10.3 cm，瓶口半徑為3.1 cm的圓柱形糖果罐）；吸蟲(chóng)器（由20 mL一次性塑料注射器改造而成）；PVC網(wǎng)罩（將PVC膜做成直徑12 cm、高度40 cm圓柱體，一端粘120目防蟲(chóng)網(wǎng)）；微蟲(chóng)籠（將2個(gè)內(nèi)徑2 cm、高0.5 cm的有機(jī)玻璃環(huán)固定在條形發(fā)夾兩翼，外部粘120目防蟲(chóng)網(wǎng)，發(fā)夾兩翼閉合時(shí)兩個(gè)有機(jī)玻璃環(huán)緊扣在一起，形成封閉的微蟲(chóng)籠，通過(guò)發(fā)夾將微蟲(chóng)籠固定在菜椒葉片上）；塑料花盆（直徑10 cm）；培養(yǎng)皿（直徑9.0 cm）；封口膜；小毛筆。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 TRIzol Reagent（天根生化科技有限公司產(chǎn)，目錄號(hào)：15596026）；TIANscript cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司產(chǎn)，目錄號(hào)：KR104）；DL2000 DNA Marker（北京全式金生物公司產(chǎn)）； Pfu PCR MasterMix（天根生化科技有限公司產(chǎn)，目錄號(hào)：KP201）；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司產(chǎn)，目錄號(hào)：DP432）；dd H2O（上海生工生物有限公司產(chǎn)）；氯仿、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇、Na2SO3、PVP、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O（天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)）。

1.1.3 其它試驗(yàn)材料 供試番茄斑萎病毒毒源：由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，一部分置于-80℃冰箱中保存，另一部分用于菜椒植株接種；

健康菜椒植株：品種為“常豐大菜椒”，在以120目防蟲(chóng)網(wǎng)隔離的育苗盤中培養(yǎng)至四葉期，除去弱苗，單株移栽在花盆中作為健康試驗(yàn)植株；

帶毒菜椒植株：選取四葉期的健康菜椒植株，采用人工摩擦接種方法接種番茄斑萎病毒，接種后置于溫度（26±1）℃、相對(duì)濕度（70±5）%、光照L∶D=14∶8的光照培養(yǎng)箱中，15 d后做PCR檢測(cè)，選取帶毒植株作為試驗(yàn)植株；

健康棕櫚薊馬：采自濟(jì)南市商河縣玉皇廟街道辦事處西甄村日光溫室菜椒植株，室內(nèi)用蕓豆連續(xù)多代飼養(yǎng)，建立穩(wěn)定種群；

帶毒棕櫚薊馬：在以120目防蟲(chóng)網(wǎng)隔離的帶毒菜椒苗上接健康棕櫚薊馬，持續(xù)飼養(yǎng)2個(gè)月，選取初羽化棕櫚薊馬成蟲(chóng)，一部分做PCR檢測(cè)，明確其帶毒率，另一部分用于棕櫚薊馬傳毒試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棕櫚薊馬若蟲(chóng)對(duì)番茄斑萎病毒的獲毒能力 選取帶毒菜椒植株上的嫩葉，置于培養(yǎng)皿中，下墊濕潤(rùn)濾紙保濕。在葉片上接健康棕櫚薊馬1齡若蟲(chóng)（孵化6 h內(nèi)），用封口膜將培養(yǎng)皿封口后置于溫度（26±1）℃、相對(duì)濕度（70±5）%、光照L∶D=14∶8的光照培養(yǎng)箱中。分別在接蟲(chóng)后0.5、1、3、6、12、24、48、96 h將棕櫚薊馬若蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到養(yǎng)蟲(chóng)瓶中，在相同溫濕度條件下用蕓豆分別飼養(yǎng)，每個(gè)時(shí)間處理重復(fù)3次。待棕櫚薊馬成蟲(chóng)羽化后，用PCR方法單頭檢測(cè)棕櫚薊馬雌成蟲(chóng)帶毒情況，每重復(fù)檢測(cè)棕櫚薊馬雌成蟲(chóng)20頭，計(jì)算帶毒率。

1.2.2 棕櫚薊馬成蟲(chóng)對(duì)番茄斑萎病毒的傳毒能力 將帶毒棕櫚薊馬雌成蟲(chóng)置于微蟲(chóng)籠中，每微蟲(chóng)籠放1頭；將微蟲(chóng)籠固定在健康菜椒葉片上，每株菜椒植株固定微蟲(chóng)籠1個(gè)，菜椒植株接蟲(chóng)后罩PVC網(wǎng)罩。分別在接蟲(chóng)后0.5、1、3、6、12、24、48、96 h去除微蟲(chóng)籠并殺死籠中薊馬，使菜椒苗在PVC網(wǎng)罩中繼續(xù)生長(zhǎng)，每個(gè)時(shí)間處理重復(fù)3次，每重復(fù)菜椒苗40株。20 d后用PCR方法單株檢測(cè)菜椒苗帶毒情況，用菜椒苗帶毒株率除以棕櫚薊馬帶毒率，即棕櫚薊馬理論傳毒效率。

1.2.3 日光溫室中番茄斑萎病毒病的發(fā)生與棕櫚薊馬種群動(dòng)態(tài)的關(guān)系 試驗(yàn)在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所日光溫室中進(jìn)行，日光溫室面積約200 m²。菜椒定植時(shí)間為2015年3月10日，每666.7m²栽2 400株左右，長(zhǎng)勢(shì)良好；定植時(shí)在菜椒行間均勻放入4株盆栽帶毒菜椒，作為毒源植株。4月初～6月初調(diào)查日光溫室中棕櫚薊馬和番茄斑萎病毒病發(fā)生情況，每隔10 d左右調(diào)查一次，共調(diào)查7次。調(diào)查方法：在日光溫室東、西兩側(cè)分別保留1垅菜椒做保護(hù)行，將日光溫室自東向西平均分為5小區(qū)，在每個(gè)小區(qū)的中間位置選取菜椒2行，在每行菜椒的南、中、北各標(biāo)記5株代表性菜椒植株，每株菜椒上選取4朵花，調(diào)查棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量，同時(shí)采集標(biāo)記菜椒上的葉片，室內(nèi)PCR檢測(cè)菜椒植株帶毒率。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕櫚薊馬若蟲(chóng)對(duì)番茄斑萎病毒的獲毒能力

棕櫚薊馬若蟲(chóng)一旦獲毒會(huì)終生帶毒，其成蟲(chóng)帶毒率可以反映若蟲(chóng)獲毒能力，成蟲(chóng)帶毒率越高，若蟲(chóng)獲毒率越高，反之亦然。試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，棕櫚薊馬若蟲(chóng)的獲毒能力隨著飼喂帶毒菜椒植株時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高。健康棕櫚薊馬若蟲(chóng)在帶毒菜椒植株上飼喂0.5 h，棕櫚薊馬成蟲(chóng)不帶毒；飼喂1 h后棕櫚薊馬成蟲(chóng)開(kāi)始帶毒，但帶毒率極低，只有1.67%；飼喂3～12 h，棕櫚薊馬成蟲(chóng)帶毒率較低，僅為3.33%～8.33%，處理間無(wú)顯著差異；飼喂24～96 h，棕櫚薊馬成蟲(chóng)帶毒率略有提高，達(dá)15.00%～18.33%，該時(shí)間段不同處理間無(wú)顯著差異，但顯著高于飼喂12 h處理。

2.2 棕櫚薊馬成蟲(chóng)對(duì)番茄斑萎病毒的傳毒能力

試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，棕櫚薊馬成蟲(chóng)的理論傳毒效率隨著飼喂健康菜椒植株時(shí)間的延長(zhǎng)先逐漸提高最后降低。帶毒棕櫚薊馬成蟲(chóng)在健康菜椒植株上飼喂0.5 h，其理論傳毒效率較低（4.55%）；飼喂1～6 h，其理論傳毒效率略有增長(zhǎng)，為13.64%～22.73%，處理間無(wú)顯著差異；飼喂12～48 h，其理論傳毒效率進(jìn)一步提高，在飼喂48 h時(shí)達(dá)最高（59.10%），處理間無(wú)顯著差異；飼喂96 h，其理論傳毒效率有所下降，但和48 h時(shí)無(wú)顯著差異。

2.3 日光溫室中番茄斑萎病毒病的發(fā)生與棕櫚薊馬種群動(dòng)態(tài)的關(guān)系

調(diào)查結(jié)果（圖3）顯示，調(diào)查期間日光溫室菜椒植株上棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，4月初第一次調(diào)查時(shí)未見(jiàn)棕櫚薊馬成蟲(chóng)，至5月中旬（平均單花蟲(chóng)量為0.86頭），棕櫚薊馬成蟲(chóng)緩慢增加，5月中旬以后棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量迅速增加，6月初時(shí)平均單花蟲(chóng)量達(dá)2.98頭。從番茄斑萎病毒病發(fā)生情況來(lái)看，至4月24日調(diào)查時(shí)日光溫室無(wú)帶毒番茄植株，5月上旬帶毒植株出現(xiàn)，但植株帶毒率較低，至5月中旬前（4.00%）緩慢增加，而后迅速增加，至6月初番茄植株帶毒率達(dá)22.00%。

從番茄斑萎病毒病發(fā)生與棕櫚薊馬種群動(dòng)態(tài)之間的關(guān)系來(lái)看，菜椒植株帶毒率與棕櫚薊馬成蟲(chóng)密度密切相關(guān)，且病毒病的發(fā)生具有一定滯后性：4月下旬之前，棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量較低，菜椒植株不帶毒；4月下旬～5月中旬，棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量略有提高，菜椒帶毒植株開(kāi)始出現(xiàn)，但帶毒率較低；5月下旬～6月初，棕櫚薊馬成蟲(chóng)數(shù)量增長(zhǎng)迅速，菜椒植株帶毒率亦呈快速增長(zhǎng)狀態(tài)。

3 結(jié)論與討論

番茄斑萎病毒病是我國(guó)蔬菜上的重要病毒病，繼我國(guó)云南等地猖獗發(fā)生危害以來(lái)，現(xiàn)已在我國(guó)北方部分蔬菜產(chǎn)區(qū)發(fā)生。番茄斑萎病毒不能通過(guò)寄主植物自身垂直或水平傳播[12， 13]，而是以薊馬作為傳毒介體傳播。本研究結(jié)果顯示，用帶毒菜椒植株飼喂健康棕櫚薊馬若蟲(chóng)24 h后，棕櫚薊馬帶毒率達(dá)15.00%以上，帶毒棕櫚薊馬成蟲(chóng)取食健康菜椒植株12～96 h，其理論傳毒效率可達(dá)36.37%～59.10%，表明棕櫚薊馬若蟲(chóng)具有一定獲毒能力，其成蟲(chóng)具有一定傳毒能力。本試驗(yàn)中雖然棕櫚薊馬個(gè)體的獲毒和傳毒能力有限，但棕櫚薊馬是菜椒、茄子、黃瓜等設(shè)施蔬菜主要害蟲(chóng)，該害蟲(chóng)在設(shè)施蔬菜上種群密度極高，成蟲(chóng)活動(dòng)性較強(qiáng)，容易導(dǎo)致番茄斑萎病毒病的傳播和蔓延[14]，給我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)造成重大威脅。

日光溫室調(diào)查結(jié)果表明，番茄斑萎病毒病的發(fā)生危害與棕櫚薊馬種群動(dòng)態(tài)密切相關(guān)，日光溫室中番茄斑萎病毒病的發(fā)生危害程度取決于棕櫚薊馬的發(fā)生數(shù)量。日光溫室無(wú)棕櫚薊馬或有棕櫚薊馬但數(shù)量極低時(shí)，菜椒植株不帶番茄斑萎病毒；當(dāng)棕櫚薊馬種群達(dá)到一定數(shù)量后，帶毒菜椒植株開(kāi)始出現(xiàn)；棕櫚薊馬種群密度增長(zhǎng)較快時(shí)期則是菜椒病株率迅速增長(zhǎng)時(shí)期。因此，有效控制日光溫室中棕櫚薊馬的種群數(shù)量，是防治番茄斑萎病毒病的重要措施之一。

本研究初步測(cè)定了棕櫚薊馬對(duì)番茄斑萎病毒的傳毒特征和日光溫室中番茄斑萎病毒病發(fā)生危害與棕櫚薊馬種群動(dòng)態(tài)的關(guān)系，但本試驗(yàn)是在特定環(huán)境條件下進(jìn)行的，棕櫚薊馬對(duì)番茄斑萎病毒獲毒、傳毒能力會(huì)因溫度、濕度、寄主種類等因素不同而有較大差異，這些因素對(duì)棕櫚薊馬傳毒特征的影響有待進(jìn)一步研究。另外，本研究中番茄斑萎病毒病的發(fā)生與棕櫚薊馬種群動(dòng)態(tài)關(guān)系是在日光溫室中相對(duì)穩(wěn)定條件下進(jìn)行的，在生產(chǎn)實(shí)踐中，番茄斑萎病毒病的發(fā)生還會(huì)受蔬菜種植模式、管理水平、農(nóng)事操作等多種因素的影響，這些因素對(duì)番茄斑萎病毒病的危害亦有待進(jìn)一步研究。

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