近10年貝母類藥材鑒定技術研究進展

李明哲　韓金秀

摘要：本文通過查閱近年來相關資料，從性狀、顯微、分子標記、高效液相等鑒定，概述貝母類藥材鑒定技術近年來的研究進展，為今后貝母類藥材的鑒定提供參考。

關鍵詞：貝母類藥材；鑒定技術；研究進展

中圖分類號：R282.5 文獻標識碼：A DOI編號：10.14025/j.cnki.jlny.2016.10.028

貝母類藥材作為臨床上的常用藥，其來源復雜，經(jīng)常出現(xiàn)偽品。本文綜述貝母類藥材的鑒定方法，對今后的貝母類藥材的應用有較高的實踐意義。

1 性狀鑒定

性狀鑒定主要是觀察完整的中藥及中藥飲片。唐生斌等運用性狀的不同特征對貝母類藥材及它的混淆品、偽品等進行對比研究，得出不同樣品的性狀具有一定的差異，可以將性狀特征的差異作為貝母屬種間鑒別的參考依據(jù)。

浙貝母：扁圓球形，高10～20毫米，直徑10～35毫米，二瓣，類腎形，近等大，表面稍粗糙，類白色至淡黃色，內(nèi)表面淡棕色。

湖北貝母：扁圓球形，高6～22毫米，直徑6～35毫米，二瓣，類腎形，多數(shù)大小懸殊，表面稍粗糙（有的可見棕色斑點），類白色至淡棕色。

伊貝母：新疆貝母為類球形略扁，高5～10毫米，直徑6～12毫米，二瓣，月牙形，近等大，緊靠，類白色，表面光滑。伊犁貝母為圓錐形或類球形，高8～12毫米，直徑10～25毫米，二瓣，心形，近等大，類白色或淡黃色，表面稍粗糙。

平貝母：扁球形，高5～10毫米，直徑6～20毫米，二瓣，大小相近相對抱合，乳白色或淡黃白色，表面光潔。

川貝母：松貝為類圓錐形或近球形，高3～8毫米，直徑3～9毫米，二瓣，大小懸殊，呈懷中抱月形，類白色，表面光潔。青貝為類球形或扁球形，高4～14毫米，直徑4～16毫米，二瓣，大小相近，相對抱合，類白色，表面光潔。爐貝為長圓錐形或略扁斜，高7～25毫米，直徑5～25毫米，二瓣，大小相近，相對抱合，類白色或淺棕黃色，表面有的具有棕色斑點。

2 顯微鑒定

顯微鑒別是鑒別貝母類藥材的重要方法之一，可以通過藥材的粉末顏色，淀粉粒大小、形狀，層紋形狀、有無，臍點位置、形狀等多種因素進行區(qū)別。

通過比較可知，浙貝母粉末為淡黃色，湖北貝母、川貝母、伊貝母、平貝母粉末為類白色。浙貝母區(qū)別于其他貝母的最大區(qū)別是可見草酸鈣針晶，川貝母、平貝母、伊貝母粉末均有多臍點單粒和復粒，川貝母中多臍點單粒數(shù)目最多，浙貝母中復粒最多。平貝母、浙貝母、伊貝母粉末中的淀粉顆粒邊界較光滑，湖北貝母有起伏，而川貝母有短分枝，這可分別作為鑒別湖北貝母和川貝母的一大特征。湖北貝母淀粉粒層紋最為明顯，這一特點也成為5種貝母中湖北貝母的最大鑒別特征。

3 薄層色譜（TCL）鑒定

黃小鷗等“采用了氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水（40：40：15：10）的下層溶液和正己烷-醋酸乙酯-二乙胺（11：14：1：5）兩個溶劑系統(tǒng)作為鑒別湖北貝母、川貝母、平貝母、浙貝母和伊貝母薄層色譜法的溶劑系統(tǒng)，通過譜圖可知伊貝母中含有西貝母堿，無貝母素甲和貝母素乙，而其他四種貝母則含有貝母素甲和貝母素乙，無西貝母堿。吳曉民等運用薄層色譜法對不同品種、產(chǎn)地、采收期的平貝母和偽品之間進行了比較和分析，其結果顯示，不同采收期及不同產(chǎn)地的平貝母譜圖相近，而不同品種的平貝母和平貝母偽品的譜圖之間有著明顯差異，所以采用薄層色譜（TCL）鑒定法可以對平貝母藥材的鑒別提供有利依據(jù)。

4 分子標記鑒定

從分子遺傳學角度來看，基因型的差異是物種表現(xiàn)型的主要差異，即DNA序列上的差異，這種差異是個體的差異并且不受環(huán)境影響，所以通過對基因型差異的比較研究也能進行植物分類和鑒定。同時隨著新科學技術的不斷發(fā)展創(chuàng)新，出現(xiàn)了分子生物學鑒定方法，所以通過分子標記技術對中藥基原植物及其飲片鑒定得到了極大的發(fā)展。

4.1 隨機引物擴增多態(tài)性DNA（RAPD）

李玉鋒等運用RAPD技術分析了8種貝母其基因組DNA多態(tài)性以及構建了樹狀聚類圖，結果顯示親緣關系最近的為產(chǎn)地相同的川貝母和康定貝母，但產(chǎn)地不同的伊貝母、浙貝母、平貝母與川貝母等相同產(chǎn)地的貝母遺傳距離相對較遠。因此可知，地理的分布距離越小，貝母的遺傳差異性越小，反之則越大。尹春萍等對暗紫貝母和湖北貝母采用RAPD法篩選出特異性高的引物進行準確區(qū)分。龔伯奇通過RAPD技術進行分析了青海省四個地區(qū)的暗紫貝母遺傳多樣性，通過獲得的多態(tài)性信息將每個樣地的樣品準確地將聚類在一起。周潔采用RAPD標記和ISSR標記相結合的技術對12個浙貝母的品種進行了分子鑒定，將地種植的貝母類群和磐安引種貝母劃分開，發(fā)現(xiàn)了RAPD的聚類結果與ISSR標記得到的聚類結果基本一致，從而肯定了RAPD技術的鑒定準確性。

4.2 簡單重復區(qū)間標記技術（inter-simple sequencerepeat，ISSR）

通過對SSR技術進行改進后得到了新型分子標記技術，ISSR技術是以SSR序列為引物并在3'端或者5'端加上2～4個隨機核苷酸，PCR過程中使錨定引物引起特意位點的退火，使重復序列間DNA片段成功擴增。因為不同物種、不同品種的SSR在基因組中的位置和數(shù)量均具有差異性，所以擴增結果將不同，這種結果又叫做多態(tài)性。劉曉賢等對2個川貝母居群、1個皖貝母居群、1個東貝母居群和8個浙貝母居群采用ISSR-PCR技術進行分析，結果表明和其他產(chǎn)區(qū)浙貝居群相比，磐安地區(qū)的浙貝居群有明顯的區(qū)別，且長期的留種栽培使磐安浙貝遺傳多樣性水平降低，所以形成了相對穩(wěn)定的遺傳。王果平等運用ISSR技術對新疆貝母屬的遺傳多樣性進行聚類分析，把十種貝母分成三個類群。結果表明聚類在一起的為托里貝母、黃花貝母、小白花貝母和大白花貝母。趙鑫等㈣探究了Mg²⁺濃度、引物、dNTP和TagDNA聚合酶用量這四個要素對伊貝母ISSR-PCR擴增的影響，并確定了伊貝母ISSR反應體系，這對其他貝母屬藥用植物的ISSR反應體系的建立具有指導作用。

4.8 DNA條形碼技術鑒定

通過選取進化速率較快、普遍性高以及種內(nèi)遺傳較為穩(wěn)定的DNA序列，設計相對應的引物，使用PCR技術擴增出待鑒定物種對應DNA片段序列，通過直接測序的方法獲得序列信息，并運用MEGA等軟件比對序列信息，便能對其進行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育構件，這種技術稱為DNA條形碼技術。這種技術具有操作簡單，重復性強，不受樣品個體差異和環(huán)境影響，鑒定效率高等優(yōu)點。余超等在貝母屬植物中采用DNA條形碼技術從8個貝母屬21個樣品中提取了基因組DNA，進行ITS1、ITS2序列的PCR擴增和測序，并比較了各樣品DNA提取率、PCR擴增率及測序成功率。最終測序數(shù)據(jù)經(jīng)過BLAST搜索法評價、SPSS軟件分析及MEGA軟件的構建，其結果表明ITS2序列能夠更準確鑒定不同物種貝母，適合作為貝母屬植物的通用條形碼序列。譚瑩等通過研究建立了川貝母DNA指紋鑒別方法，結果顯示川貝母能擴增出的片段可達到274bp，而其余貝母均未擴增出相應片段。由于此種方法具有簡便、快速及結果可靠的優(yōu)點，所以可作為川貝母及其偽品之間鑒定的有效手段。李敏等對浙貝母Fritillaria thunbergii通過特異性引物進行特異性PCR鑒定，結果顯示浙貝母在約750 bp處出現(xiàn)特異性條帶，其他貝母品種屬則未出現(xiàn)相應條帶。羅焜等也使用ITS2序列技術對川貝母基原植物及其混偽品進行了準確區(qū)分，并將太白貝母、梭沙貝母、瓦布貝母、暗紫貝母、卷葉貝母、甘肅貝母這六種不同的川貝母基原植物聚類在一起，驗證了藥典的準確性。

4.4 其他分子標記技術

主要通過對編碼蛋白質的mRNA進行逆轉錄，同時構建物種cDNA文庫，通過ESTs圖譜區(qū)分基因水平的差異，這種技術叫做表達序列標簽（expressed sequence tags，ESTs）技術?，F(xiàn)今，在川貝母的cDNA文庫中，已經(jīng)有超過1343個獨特的轉錄組和超過2158條高品質的ESTs序列信息。目前發(fā)現(xiàn)的川貝母生化活性相關的轉錄集合主要包括氨基酸轉移酶、FPSs、CYP450s、HMGR等數(shù)十個，為貝母甾體生物堿合成相關的轉錄組基因鑒定技術提供了進一步的支持。

5 傅里葉變換紅外光譜法FTIR

利用FTIR中的OMNI采樣器直接測定藥材紅外光譜，可減少萃取或粉碎過程中增加的不確定因素，增大結果的可信度。程存歸等通過本方法對小東貝、珠貝和川貝母進行鑒別，結果表明芯芽的紅外光譜是三者之間最大的區(qū)別。葉曉鐳等采用本方法對甘肅貝母、暗紫貝母等26種貝母類藥材及其偽品進行分析鑒定，其結果顯示對于區(qū)分不同種類的貝母及其偽品時本方法是準確可行的。

6 高效液相色譜法

張國欣等運用高效液相色譜法建立并分析了湖北貝母的指紋圖譜。李玉鋒等通過指紋圖譜研究顯示，貝母素甲是貝母類藥材主要的生物堿之一，但是含量在不同貝母之間差別比較大，本研究有助于貝母指紋圖譜的建立。蔡曉翠等對10批不同種植區(qū)的伊貝母通過HPLC-ELSD指紋圖譜進行研究，發(fā)現(xiàn)色譜峰整體特征具有很高的相似度，伊犁不同產(chǎn)區(qū)的伊貝母中西貝母堿含量有著顯著的差異，并且在同一產(chǎn)區(qū)不同采收期其西貝母堿含量也存在著差異。

周建良等運用快速液相色譜對產(chǎn)于不同地區(qū)浙貝母的主要成分特征圖譜進行比較分析，強調了在高度精確的定量分析基礎上各藥材之間含量及化學成分上的差異，可作為不同貝母品種的區(qū)分依據(jù)以及為藥材的規(guī)格、品級和同種采收季節(jié)和藥材地提供定量數(shù)據(jù)支持。賀美艷等采用高效液相色譜法對浙貝、川貝、平貝、新疆貝母中鳥苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷的含量進行檢測，最終確定尿嘧啶能夠與鳥苷、尿苷、腺苷線性良好，同時達到基線分離，指標成分含量在四種貝母中具有顯著的差異。

7 三相靜態(tài)萃取HPLC鑒定法

于海英等采用不同洗脫梯度、同一流動相系統(tǒng)，通過液-液-液三相靜態(tài)萃取技術制備樣品的方法，測定五種貝母的不同萃取餾分，其中極性萃取餾分的譜圖基線、分離度及對稱性較好，從而確定可以采用三相靜態(tài)萃取HPLC鑒定法對貝母類藥材進行鑒定及相關質量評價。

8 近紅外漫反射光譜法

鄧波等對東北平貝母、浙貝母、川貝母的48個樣品通過近紅外漫反射光譜和主成分分析法相結合的方法進行分析，最終發(fā)現(xiàn)近紅外漫反射光譜分析法可以較好地表征48個樣品的類別關系，從而確定近紅外漫反射光譜法可用于鑒定及區(qū)分貝母類藥材。高越等對十種貝母藥材通過褶合變換一可視化一相似系數(shù)分析、近紅外漫反射光譜并和聚類分析等相結合的方法進行分析，結果顯示聚類分析可將3種貝母偽品和7種貝母正品區(qū)別開來，褶合變換一可視化一相似系數(shù)分析方法則可以更詳細的區(qū)分貝母正品之間的微小差異，從而改善了正品貝母之間的鑒別效果，同時為貝母正品之間的鑒別提供有利依據(jù)。

9 熱分析法

王書軍等對九種貝母類藥材進行熱分析，并得出結論，不同的氣候，不同的地理環(huán)境和不同來源的貝母的熱分析圖譜之間存在顯著差異。其中平貝母與湖北貝母的差熱圖譜有明顯差異，平貝母的熱穩(wěn)定性最差，而湖北貝母的熱穩(wěn)定性最高。因此可以通過貝母類藥材熱分析圖譜的差異，更簡單的對其進行鑒別與區(qū)分。

10 X射線粉末衍射法

王書軍等對五種貝母類藥材通過x射線衍射進行了分析測定，通過對譜圖分析可知，湖北貝母、伊貝母、平貝母和浙貝母中淀粉屬于B型，川貝母中淀粉屬于CB型，且五種貝母的粉末結晶度完全不同，因此可運用X射線粉末衍射圖譜分析、藥材本身淀粉顆粒的晶體類型和藥材中粉末結晶度相結合的方法，進行貝母類藥材的分析鑒別。

11 電噴霧質譜法

韓鳳梅等例通過電噴霧離子阱質譜法對五種貝母中貝母生物堿進行分析，通過五種貝母對照藥材的總生物堿提取液的一級電噴霧質譜圖譜可知，這五種貝母主要的分子峰和離子峰基本相同，但是相對豐度差異較大。其結果顯示五種貝母類藥材生物堿提取物的電噴霧質譜圖譜特征性較強，并且它們的精密度和重現(xiàn)性也較好，所以可通過此方法對不同貝母類藥材進行鑒別。

12 結語

通過對近十年貝母類藥材的鑒別進行歸納總結可以看出：貝母類藥材鑒別方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的性狀鑒別向經(jīng)典的顯微鑒別發(fā)展，從現(xiàn)代的光譜、色譜理化鑒別技術向DNA條形碼和多態(tài)性分析等為特征的分子水平延伸。同時隨著生物技術的不斷發(fā)展進步，SNP技術、ESTs技術、系統(tǒng)生物學技術和基因芯片技術能為貝母類藥材研究提供有力的幫助。因貝母類藥材分布廣泛，同時具有良好的藥用價值，市場的需求量大，所以建立完整的貝母類藥材鑒定，對該類藥材的市場監(jiān)管具有極其重要的意義。