一種從羊奶中檢測牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR方法的建立

范陽陽 張犖嘉 劉艷艷 卞如如 霍勝楠 張卉 張全芳 步迅

摘要：羊奶制品因其良好的營養(yǎng)功效備受消費者的青睞，也是乳制品主要摻假對象。本研究參考市場可能摻假現(xiàn)狀，分別根據(jù)羊和牛線粒體基因組16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，設(shè)計一對牛和羊特異性引物、一對大豆特異性引物以及相應(yīng)的TaqMan-MGB 探針，建立羊奶中牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR檢測方法，并引入內(nèi)標質(zhì)控有效保證檢測體系的準確性。本檢測體系對羊奶、牛奶及豆?jié){的基因組DNA檢測敏感度為0.01 ng；對羊奶中摻入牛奶和豆?jié){的體積摻假檢測靈敏度均為0.1%。因此，本研究建立的羊奶中牛奶和大豆成分多重實時熒光定量PCR檢測體系具有通量大、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點，實現(xiàn)了對羊奶中其他源性成分快速、準確的檢測，對保障相關(guān)產(chǎn)品市場安全具有重要意義。

關(guān)鍵詞：羊奶；牛奶；豆?jié){；多重實時熒光定量PCR

中圖分類號：S879.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0118-06

由于羊奶中含有的維生素和微量元素均高于牛奶，并且含有大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白結(jié)構(gòu)成分與母乳基本相同，被營養(yǎng)學界稱之為“奶中之王”[1]。羊奶中不含引起人體過敏的異性蛋白，尤其適合胃腸較弱、體質(zhì)較差的嬰幼兒飲用，但市場上的羊奶品質(zhì)參差不齊。隨著消費者認可度的不斷提高，在利益的驅(qū)動下，在羊奶中摻入牛奶或者豆?jié){的現(xiàn)象非常普遍，摻假手段多種多樣，不斷變換，僅靠感官鑒評和傳統(tǒng)的試驗方法已不能滿足市場需要[2]，嚴重影響我國奶業(yè)的健康發(fā)展。

目前，用于檢測羊奶摻假的方法主要有氣象色譜、液相色譜、電泳、PCR、ELISA和近紅外光譜法等[3～6]。實時熒光定量PCR方法是以DNA為基礎(chǔ)的一種檢測技術(shù)，不受摻假形式的影響，可以進行快速、批量、自動、實時檢測分析，具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)點，已經(jīng)在動物源性成分檢測項目上逐步取代一般PCR方法成為最常用的分子生物學檢測手段[7]。為了保障羊乳及其產(chǎn)品品質(zhì)，確保消費者的利益，建立準確檢測牛羊乳及豆?jié){混摻的技術(shù)越來越重要。本試驗旨在利用TaqMan探針實時熒光定量PCR方法，建立一種快速、準確檢測羊奶中是否摻有牛奶和豆?jié){的方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗材料試驗所用標準液態(tài)牛奶、液態(tài)羊奶取自山東省畜牧研究所奶牛及山羊養(yǎng)殖基地，液態(tài)豆?jié){是本實驗室用大豆加工而成。市售樣品為購自濟南市大、中、小型超市的不同品牌奶制品。

1.1.2主要試劑與儀器試劑：Chelex-100（天根生化科技有限公司，北京）、蛋白酶K（TaKaRa，日本）、核算定量檢測試劑盒（TaKaRa，日本）。

儀器：ABI7500實時熒光定量PCR儀（ABI，美國）、高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）、Nanodrop 核酸蛋白含量測定儀（Eppendorf，德國）。

1.2試驗方法

1.2.1樣品基因組DNA的提取分別取牛奶、羊奶、豆?jié){液體樣品2 mL加入2 mL無菌離心管中，2 500 r/min、4℃恒溫離心30 min，棄上清液保留沉淀；向離心管中加入1 mL無菌磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，3 500 r/min室溫離心10 min，棄上清；向沉淀中分別加入280 μL 5%Chelex-100和20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育30 min，漩渦震蕩10 s混合均勻，100℃煮沸8 min，13 000 r/min離心3 min；將上清加入吸附柱中13 000 r/min離心1 min收集液體；向收集液中加入20 μL GlassMilk 和600 μL gDNA Binding Buffer充分混勻，65℃水浴15 min（其間不斷輕柔地上下翻轉(zhuǎn)離心管），室溫放置5 min（其間不斷輕柔上下翻轉(zhuǎn)離心管）；4 000 r/min離心1 min，棄上清；向離心管中加入500 μL 70%乙醇，8 000 r/min離心1 min，棄上清，重復2次；加入500 μL無水乙醇輕輕混勻，8 000 r/min離心1 min，棄上清；8 000 r/min離心30 s，用10 μL槍頭吸走殘余液體，室溫放置至徹底干燥；加入100 μL TE（pH 7.0）70℃水浴5 min，瞬間離心，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肗anodrop 核酸蛋白含量測定儀測定核酸濃度。

1.2.2引物及探針設(shè)計分別參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高度保守的16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計牛奶、羊奶通用引物序列（UF、UR），大豆引物序列（Lectin-F、Lectin-R），內(nèi)參引物序列（IACF、 IACR）。使用Beacon Designer 2.0 設(shè)計特異分子信標（MB）探針，其中牛奶探針（NP）用CY3標記，羊奶探針（YP）用JOE標記，豆?jié){探針（LectinP）用FAM標記，內(nèi)標探針（IACP）用ROX標記，3′端的淬滅基團用Dabcyl修飾。引物及探針序列見表1。

1.2.3多重實時熒光定量PCR檢測體系建立通過優(yōu)化反應(yīng)體系中的引物濃度、探針濃度和退火溫度等條件，建立分別檢測羊、牛和大豆源性成分的單重熒光定量PCR體系。將4種引物及探針組合在一起，分別或同時以羊、牛和大豆基因組DNA為模板，優(yōu)化引物、探針濃度和退火溫度等反應(yīng)體系和條件，建立能同時檢測羊、牛和大豆源性成分的多重熒光定量PCR體系。

1.2.4結(jié)果判定實時熒光定量PCR擴增結(jié)束后獲取Ct值，當Ct值<35時，視為檢出動物源性成分；當Ct值≥35時，視為未檢出動物源性成分。

1.2.5基因組DNA檢測靈敏度試驗分別提取羊奶、牛奶及豆?jié){的基因組DNA，用Nanodrop定量到50 ng/μL，做10倍梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4），對每個梯度按照優(yōu)化后的擴增體系和條件分別進行檢測。

1.2.6羊奶中摻雜牛奶或豆?jié){靈敏度試驗將豆?jié){和羊奶以一定體積比例混合，制成豆?jié){含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品；將牛奶和羊奶以一定比例混合，制成牛奶含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品。按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件分別進行檢測。

1.2.7市售樣本檢測使用優(yōu)化后的熒光定量PCR方法對35份奶制品樣本進行源性鑒定，驗證檢測方法的實用價值。

2結(jié)果與分析

2.1多重實時熒光定量PCR檢測體系的建立

參照優(yōu)化的單重熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件，將羊、牛、大豆和內(nèi)標質(zhì)控的引物及探針組合在一起，先分別以羊、牛和大豆基因組DNA為模板優(yōu)化反應(yīng)體系，然后同時加入3種基因組DNA模板，通過調(diào)整反應(yīng)體系中主要成分濃度和體積以及反應(yīng)條件，優(yōu)化反應(yīng)體系，最終篩選出最適宜的多重實時熒光定量PCR體系。20 μL反應(yīng)體系包括5× Premix 4 μL，HS-Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，引物 Mix（2 μmol/L）2 μL， 探針 Mix（2 μmol/L）2 μL，內(nèi)標質(zhì)控IAC DNA模板（1 ng/μL）2 μL，檢測樣品DNA 模板2 μL，雙蒸水7.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40個循環(huán)，60℃延伸時收集熒光信號。圖1為多重實時熒光定量PCR擴增曲線圖，其中A圖同時檢測出羊和牛源性成分，大豆源性為陰性；B圖樣本中同時檢測出大豆和牛源性成分，羊源性成分為陰性。

2.2基因組DNA靈敏度試驗

結(jié)果（圖2）顯示，當模板DNA濃度稀釋至10-4倍，即DNA質(zhì)量為0.01 ng時，所建立的熒光定量PCR檢測體系仍然能夠產(chǎn)生良好的特異擴增曲線。此時純羊奶、牛奶及豆?jié){模板檢測到的Ct值分別為33.64±0.02、34.80±0.018和34.87±0.03，均<35，因此確定本研究中多重實時熒光定量PCR體系模板DNA質(zhì)量檢測下限為0.01 ng。

2.3羊奶中摻雜牛奶或豆?jié){靈敏度試驗

將牛奶或豆?jié){以0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的體積比摻入至純羊奶中，結(jié)果顯示當牛奶或豆?jié){含量為0.1%時，多重實時熒光定量PCR體系仍有特異性擴增曲線，并且其Ct值均<35（圖3A、B），且隨著牛奶或豆?jié){摻入比例增加，Ct值越來越小。說明本研究建立的多重實時熒光定量PCR檢測體系對牛奶和豆?jié){的體積摻假檢測限為0.1%。

2.4市售樣本的實際檢測

利用本研究建立的羊奶中牛奶和大豆源性多重熒光定量PCR檢測體系對35份市售羊奶、羊奶粉、牛奶、牛奶粉進行源性鑒定。結(jié)果如表2所示，15份羊奶及相關(guān)制品中都含有羊源性成分，其中10份含有牛源性成分，4份含有大豆成分，分別占樣本總數(shù)的66%和26%；20份牛奶及相關(guān)制品中全部檢出牛源性成分，9份樣品中檢測出大豆成分，占樣本總數(shù)的45%。

3討論與結(jié)論

目前現(xiàn)有的牛羊乳檢測方法多是依據(jù)羊乳和牛乳化學組成上的差異，以牛羊乳中蛋白質(zhì)、脂肪、DNA、維生素等為特征指標進行檢測[8]。色譜-質(zhì)譜結(jié)合技術(shù)是分離蛋白質(zhì)、定量檢測牛羊乳混摻的重要方法，有研究表明該方法可以實現(xiàn)牛羊乳混摻的快速檢測，能檢測牛羊混合乳中牛乳含量的最低水平為5%[9]。毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）技術(shù)也在牛羊乳檢測中得到了應(yīng)用[10]，但存在檢測靈敏度偏低的缺點[11]。利用近紅外光譜法檢測摻假羊奶需要足夠的專業(yè)知識，建立模型才能對檢測結(jié)果進行分析，對檢測人員的要求較高，不易普及推廣[12]。熒光定量PCR方法是基于DNA水平的檢測，克服了以上技術(shù)的不足，被越來越多地應(yīng)用到奶制品的檢測中。由于核酸比蛋白質(zhì)更穩(wěn)定，抗熱能力更強，并且含有更多遺傳信息，所以基于DNA的動物源性檢測方法比蛋白免疫法更有優(yōu)勢[13]。

曾少靈等用多重實時熒光定量PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[14]；孟芳等應(yīng)用熒光定量PCR方法僅能鑒別牛、羊奶[15]；劉小艷等用實時熒光定量PCR方法檢測模擬奶制品中常見谷物成分的檢出限為0.5%[16]。本研究參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高保守的16S rRNA基因和大豆的KTi-S基因為靶基因設(shè)計探針建立多重實時熒光定量PCR檢測方法，該方法不僅能夠針對羊奶、牛奶和豆?jié){進行快速準確的鑒別，而且能對奶制品進行摻假檢測；在擴增循環(huán)內(nèi)只出現(xiàn)特異性擴增曲線無交叉擴增曲線；對純DNA含量的最低檢出濃度為0.01 ng；對模擬摻假的奶制品中目標成分的最低檢出限為0.1%（V/V），說明本研究建立的多重實時熒光定量PCR方法具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點。經(jīng)實際市售奶制品檢測驗證了其可行性和適用性，適用于奶類樣品摻假的快速檢測。

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