T細胞表位多肽疫苗對禽流感病毒的免疫保護評價

朱鳳珠 魯梅 譚劉剛 孔正杰 黃慶華 黃艷艷 楊少華 張秀美 崔言順 許傳田

摘要：為了探究NP蛋白T細胞表位多肽NP67-74-KLH對流感通用疫苗4M2e-MAP免疫效果的影響，本研究將多肽NP67-74-KLH和4M2e-MAP添加完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑后免疫BALB/c小鼠，通過攻毒保護試驗來評價免疫效果。攻毒以后小鼠體重變化曲線說明，聯(lián)合免疫多肽疫苗NP67-74-KLH和4M2e-MAP的試驗組小鼠體重變化趨勢比單一免疫4M2e-MAP合成肽疫苗更加趨于平穩(wěn)，并且聯(lián)合免疫試驗組小鼠體重恢復較快。熒光定量和肺部組織病理切片結果均表明，復合多肽（NP67-74-KLH和4M2e-MAP）能在一定程度上干擾流感病毒在臟器肺中的復制并能夠降低病毒對肺部的損傷程度，在抵抗病毒過程中可以產生有效保護。該研究為多肽疫苗聯(lián)合應用以抵抗流感研發(fā)提供了較好思路。

關鍵詞：禽流感；多肽疫苗；免疫效果

中圖分類號：S852.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0105-04

由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）各種亞型引起的禽類疾病綜合征就構成了禽流感（Avian influenza，AI），幾乎所有的野生和家養(yǎng)禽類都能感染[1]。AIV是引發(fā)流感爆發(fā)的主要病原，高變異性是該病毒的特性。從理論上講，該病毒大約有 256 個血清亞型，而這些亞型之間又可進行重新組合，進而導致病毒的不斷變異與宿主改變。二十一世紀初，對于盛行的禽流感，WHO已經(jīng)向全世界提出了警示，大多數(shù)國家和地區(qū)也已經(jīng)將禽流感作為第一監(jiān)視對象，在我國為 A 類動物疫病。AI 對全世界養(yǎng)禽業(yè)的危害日益嚴重，香港在1997年首次從1名三歲兒童體內分離到一株 H5N1亞型禽流感病毒，表明 AI不僅可以感染禽類，還正在不斷獲得感染人的能力[2]。因此當前面臨的艱巨任務是減少該病出現(xiàn)。解決這項艱巨任務最有用、最現(xiàn)實、最實惠的手段之一就是疫苗的研發(fā)與應用。疫苗的理想狀態(tài)應是，在安全性良好的條件下，不但能激發(fā)機體的體液免疫，產生和病毒中和的抗體，更能充分激發(fā)機體的細胞免疫而使病毒清除機制得到有效發(fā)揮。禽流感預防控制的關鍵措施之一是疫苗的免疫使用，使用疫苗防治HPAIV最早的的國家就是中國[3]。

目前流感疫苗的保護效率大大被疫苗株和抗原變異所限制。流感病毒亞型眾多，尋找一種具有交叉保護作用的疫苗仍然是抗流感的關鍵。

流感病毒的跨膜蛋白是M2 基質蛋白， 24 個氨基酸組成了該蛋白的胞外功能區(qū)（M2 ectodomain，M2e），該片段在不同亞型之間具有高保守性[5]。1933 年，初次分離到人流感病毒，在將近一個世紀內， M2e 在 A 型人流感病毒中只出現(xiàn)兩個氨基酸位點的改變[6]。M2e疫苗誘導的保護性免疫應答主要是由抗體介導，但是理想的抗原應該同時具備激發(fā)體液免疫和細胞免疫的能力。NP蛋白由AIV基因組中的節(jié)段 5 編碼，它同時擁有種群和型的特異性，在不同亞型病毒之間有高度保守性，該蛋白是誘導細胞毒性T 淋巴細胞（CTL） 反應的主要抗原，并且至少包括 3 個獨立的抗原位點。NP蛋白上含有大量的 CD8+T 細胞識別的表位，誘導的細胞免疫可抵御不同亞型流感病毒的感染[4]。保護機體免受病毒攻擊的主要機制是誘導機體的細胞免疫反應[7]。因此本研究旨在通過添加T細胞表位多肽NP67-74-KLH來增強抗原激發(fā)體液免疫和細胞免疫的能力，研究NP67-74-KLH+4M2e聯(lián)合免疫的效果，為更深層次的流感病毒疫苗研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗毒株和動物

H9N2禽流感攻毒株（A/chicken/Henan/A1/08），由山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所重點實驗室保存。6～8 周齡 BALB/c 雌性小鼠，購自山東大學動物醫(yī)院。

1.2主要試劑

弗氏完全佐劑（Freunds Complete Adjuavant， FCA） 和弗氏不完全佐劑（Freunds Incomplete Adjuavant， FIA），購自 SIGMA 公司；其余試劑均為進口或國產分析純。4M2e分支肽（4M2e-MAP）與多肽NP67-74-KLH，由上海生爾吉化生物技術公司合成，純度為90%。引物序列：M2e（F1：5′-gtgcgcggatcc-3′；F2：5′-ctcgagttatcaagatct-3′）。

1.3攻毒試驗

將40只6～8 周齡健康雌性 BALB/c小鼠隨機分成4組，即：一組小鼠免疫4M2e-MAP合成肽，一組同時免疫4M2e-MAP合成肽和多肽NP67-74-KLH，其余兩組小鼠作為對照組，分別免疫相同體積的弗氏佐劑和PBS。采用皮下接種的方式對小鼠進行免疫，共免疫2次，間隔2周。首免和二免劑量均為200 μL/只，且除PBS對照組外，其它三組首免輔以完全弗氏佐劑，二免輔以不完全弗氏佐劑。二免后兩周進行攻毒，攻毒方式為滴鼻，免疫劑量為106.8 EID50/只。PBS免疫對照組的小鼠不進行攻毒。攻毒前一天對小鼠進行稱重記錄，攻毒后每天同一時間稱取各組小鼠體重，比較體重變化，并在攻毒后觀察記錄小鼠的精神狀態(tài)和計算存活率。

1.4Q-PCR檢測肺臟病毒含量

攻毒的H9N2禽流感攻毒株是弱毒，對小鼠不產生致死，攻毒后3 d每組隨機取3只小鼠用干冰麻醉處死，于無菌條件下取其肺臟組織放入500 μL 含有雙抗的 PBS 中，同時加入無菌鋼珠經(jīng)碾磨機振蕩碾碎，離心后取其上清。其中400 μL用于提取RNA，反轉錄為cDNA 后采用引物進行Real-Time PCR 檢測。總反應體系20 μL：cDNA模板1 μL、SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL、去離子水8 μL，混和均勻后在熒光定量PCR儀上進行擴增。反應條件：95℃預變性2 min；95℃，10 s；55℃，15 s；72℃，20 s；擴增45個循環(huán)；72℃延伸時采集熒光信號。以鼠β-actin基因作為內參基因校正試驗的誤差。每組樣品的M2e基因 mRNA的精確拷貝數(shù)由熒光曲線的Ct值和標準曲線計算獲得。

1.5肺組織病理學觀察

于攻毒后第3 d每組隨機取3只小鼠，無菌條件下取其肺臟，在10%甲醛溶液中進行固定，之后制作HE染色切片，在顯微鏡下觀察組織切片病理變化。

2結果與分析

2.1小鼠體重變化

攻毒后觀察小鼠的精神狀態(tài)，每組差別不是很明顯，都也沒有出現(xiàn)死亡情況。小鼠體重變化如圖1，在攻毒后的第4～6 d，除PBS對照組以外，每組小鼠體重均有下降，之后小鼠體重開始回升并逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)，NP67-74-KLH+4M2e組小鼠體重回升趨勢較4M2e組要快。

2.2肺臟病毒含量的測定

將反轉錄得到的cDNA 按實驗室建立的實時熒光定量 PCR方法進行檢測。公式計算待測組目的基因相對于空白對照組的表達差異倍數(shù)（圖2）顯示，佐劑攻毒組、4M2e組和NP67-74-KLH+4M2e組樣品表達差異倍數(shù)分別為0.6783、0.4263、0.1233，佐劑攻毒組與4M2e組樣品表達差異倍數(shù)顯著高于NP67-74-KLH+4M2e組樣品（P<0.05）。表明，佐劑攻毒組的肺臟病毒含量最高，4M2e組病毒含量次之，NP67-74-KLH+4M2e組含量最低，說明免疫多肽NP67-74-KLH+4M2e組的效果優(yōu)于單獨免疫4M2e組，NP-KLH能提高4M2e的免疫效果。

2.3肺組織病理學觀察

在佐劑攻毒組中，小鼠肺臟結構被中度破壞，左上部肺泡充血，右下部肺泡炎性細胞增多，支氣管周圍有大量的淋巴細胞浸潤，小血管周圍炎性細胞浸潤，見圖 3A； NP67-74-KLH+4M2e 組小鼠的肺泡間充血并且伴隨少量的炎性細胞浸潤，見圖 3B；4M2e組小鼠肺泡充血，肺泡腔中有散在紅細胞以及纖維素樣物質滲出，見圖 3C。該結果表明，NP67-74-KLH+4M2e組小鼠能在一定程度上抵抗病毒感染。

3討論與結論

本研究實時熒光定量PCR檢測病毒含量結果表明，肺臟病毒含量佐劑攻毒組>4M2e組>NP67-74-KLH+4M2e組，說明免疫多肽NP67-74-KLH+4M2e組的效果優(yōu)于單獨免疫4M2e組，NP67-74-KLH能提高4M2e的免疫效果。該方法較有效控制了擴增產物污染所致的假陽性，是由于試驗中只有加樣品時的一次開蓋，完全閉管操作；肉眼分析結果被檢測用的熒光值所代替，這就有效避免了人為因素干擾；定量結果由計算機軟件自動化生成，其靈敏度比常規(guī)方法提高了2～3個數(shù)量級，達到了精準定量檢測，易于檢測的精確化。本方法檢測cDNA，更靈敏地反映了AIV的感染情況和排毒情況。它具有靈敏性高、特異性強、操作簡便、快速高效等優(yōu)點，還可以進行多重擴增[8]。

熒光定量檢測和肺部組織的病理切片結果均表明，各免疫組小鼠肺臟結構基本保持完整，NP67-74-KLH+4M2e組小鼠的肺泡間充血并且伴隨少量的炎性細胞浸潤，4M2e組小鼠肺泡充血，肺泡腔中有散在紅細胞以及有纖維素樣物質滲出。說明復合多肽（NP67-74-KLH和4M2e-MAP）能在一定程度上干擾流感病毒在臟器肺中的復制并能夠降低病毒對肺部的損傷程度，在抵抗病毒過程中可以產生有效的保護。該研究為多肽疫苗的聯(lián)合應用以抵抗流感的研發(fā)提供了較好的思路。

參考文獻：

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