免疫磁珠捕獲—通用引物PCR快速檢測(cè)食品中致病菌

趙爽

食品加工、生產(chǎn)和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)境是產(chǎn)生食品致病微生物污染的主要途徑，對(duì)人們的健康造成了很大威脅。本文借助各種病菌中抗血清及磁性微珠制作免疫磁珠，對(duì)食品中的致病菌進(jìn)行檢測(cè)，希望可以提高食品中致病菌的檢出率。

材料選擇

菌株。上海漢尼公司生產(chǎn)，菌種號(hào)為ATCC13706，腸炎沙門氏菌；上海漢尼公司生產(chǎn)，菌種號(hào)為ATCC7644，單增李斯特氏菌；上海漢尼公司生產(chǎn)，菌種為ATCC25931，宋氏志賀氏菌；深圳出口入境檢驗(yàn)局生產(chǎn)，菌種號(hào)為03C0077708VB01稻葉型霍亂弧菌；本實(shí)驗(yàn)室分離保存，菌種是CC008，E.coliO157：H7。

試劑選擇。上海生工生物工程技術(shù)公司生產(chǎn)的透析袋；廈門泰京生物技術(shù)有限公司的2xTaq PCR MasterMix與DNAma rker I；lgG，Dynal公司的Dyn-abeads M-280Sheep anti-Rabbit；蘭州生物制品研究所選取的H7診斷血清和志賀氏菌屬四種混合多價(jià)血；本デソカ生研株式會(huì)社產(chǎn)品為沙門氏菌A-F群“O”多價(jià)診斷血清、單增李斯特氏菌診斷血清和“OI”群霍亂弧菌診斷血清。

引物。核苷酸虛列可以表示成：

5，-AAACTCAAAGGAATTGAC GG-3，5，-GACGGGCGGTGTGTACAA-3。

方法

純化免疫球蛋白。上述五種菌利用飽和硫酸沉淀法進(jìn)行純化。首先使用濃度為50%的硫酸銨純化，然后再使用30%硫酸銨二次純化。完成沉淀后，放置在PBS中沉淀，獲得純化IgG，對(duì)IgG濃度進(jìn)行測(cè)定，調(diào)節(jié)濃度，低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

制備免疫磁珠。將磁珠放人無(wú)菌離心管內(nèi)，每管100微升，然后加入一定量牛血清蛋白液攪拌，將小管放置在磁架上靜置兩分鐘，移除液體并充分洗滌，使用上述完成的緩沖液懸浮100微升，再計(jì)人100微升純化好的IgG，緩慢振蕩30分鐘，充分洗滌，用懸浮液懸浮至100微升，放置在4攝氏度下備用。

捕獲目的菌。將上述五種免疫磁珠離心管各取一支，在各個(gè)管內(nèi)分別加入1毫升與抗體相對(duì)的各種菌液，細(xì)菌含量為10³cfu/管，搖晃一小時(shí)，充分洗滌后加入管內(nèi)液體，利用100微升的超純水對(duì)致病菌磁珠懸浮其中。

檢測(cè)磁珠捕獲效率。在羊湯中加入沙門氏菌培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)后，將其濃度調(diào)整到10⁶fu/mL。取出沙門氏菌血清免疫磁珠各100、200、400微升，同時(shí)加入沙門氏菌細(xì)菌也充分振蕩后進(jìn)行洗滌，PBS懸浮到100微升后，按倍稀釋。取出稀釋度100微升的菌落計(jì)數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)。將其中稀釋最好的菌落作為細(xì)菌回收率。該細(xì)菌收回列表表示磁珠捕獲細(xì)菌的回收率，并與空白磁珠進(jìn)行比對(duì)。

提取細(xì)菌DNA。取出已經(jīng)捕獲的免疫磁珠，將其分被加入無(wú)菌離心管中。同時(shí)選取沒(méi)有抗體的磁珠組作為對(duì)照，包被沙門氏菌抗血清且不會(huì)吸附致病菌的磁珠作為空白比對(duì)，實(shí)施沸水浴后，離心取上清，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

建立IMC-UPPCR。選取提取好的核算模板作為PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為2×PCR反應(yīng)液12.5微升，DNA模板10微升，上下游引物各0.5微升。在94攝氏度進(jìn)行5分鐘反應(yīng)，52攝氏度進(jìn)行1分鐘，72攝氏度進(jìn)行2分鐘，循環(huán)進(jìn)行35次，再在72攝氏度進(jìn)行5分鐘，將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

樣本檢測(cè)。檢測(cè)樣本分被利用IMC-UPPCR方法、GB/T4789.30-2003方法、國(guó)標(biāo)GB/T4789.4-2008等對(duì)食品樣品進(jìn)行檢測(cè)。主要對(duì)單增李斯特氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌和0157：H7含量進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證IMC-UPPCR方法的正確性，重復(fù)兩次實(shí)施檢測(cè)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算符合率。

結(jié)果

免疫磁珠捕獲效率。沙門氏菌和免疫磁珠反應(yīng)后，可以對(duì)免疫磁珠菌落輸進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)菌回收率在80%。不同體積磁珠懸液體無(wú)差異，吸附后空白磁珠培養(yǎng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。

IMC-UPPCR。將腸炎沙門氏菌、稻葉型霍亂弧菌、單增李斯特氏菌等加入到抗體免疫磁珠離心管內(nèi)部，可以發(fā)生UPPCR反應(yīng)，結(jié)果具有差異片段，現(xiàn)實(shí)陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)白條。

特異性反應(yīng)。將各種包被有血清的免疫磁珠譜或致病菌后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果可顯示特異性片段，非對(duì)應(yīng)血清無(wú)特異片段出現(xiàn)。

樣品檢測(cè)結(jié)果。使用IMC-UPPCR方法完成檢測(cè)后，可以發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌和單增李斯特氏菌結(jié)果完全一致。大腸桿菌O157：H7均呈陽(yáng)性；利用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)兩種樣品呈現(xiàn)陰性。由此可說(shuō)明，IMC-UPPCR和國(guó)標(biāo)方法結(jié)果符合，且比國(guó)標(biāo)方法敏感。

從上述分析可以看出，IMC-UPPCR方法完全可以應(yīng)用到食品中致病菌的檢測(cè)中，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)和檢測(cè)時(shí)間短暫等特點(diǎn)，保證了檢測(cè)質(zhì)量，提升了檢測(cè)率，可以廣泛應(yīng)用到食品致病菌檢測(cè)中。