響應(yīng)面法優(yōu)化辣椒堿β—環(huán)糊精包合物制備工藝

王華　王瑩　王翼　詹長娟　徐偉　喬慧

摘要：利用飽和水溶液法制備辣椒堿β-環(huán)糊精包合物，以包合率和包合物產(chǎn)率為評價指標(biāo)，通過對包合溫度、包合時間及配料比的考察，以響應(yīng)面法優(yōu)選最佳工藝條件。結(jié)果表明，辣椒堿β-環(huán)糊精包合物的最佳包合條件為包合溫度50℃，包合時間為3 h，配料比為1：1（摩爾比），此時包合物平均產(chǎn)率為53.97%，平均包合率為52.51%。采用響應(yīng)面法可優(yōu)化辣椒堿B一環(huán)糊精包合物的制備工藝，為辣椒堿藥物制劑的研發(fā)提供借鑒。

關(guān)鍵詞：辣椒堿；β-環(huán)糊精；包合物；響應(yīng)面法

辣椒堿是從辣椒屬植物中提取得到的一種天然生物堿，是辣椒中能引起辛辣味的主要成分。辣椒堿在食品、醫(yī)療、農(nóng)藥、化工涂料及軍事等領(lǐng)域均有應(yīng)用。由于辣椒堿具有多種生理活性，在臨床上已被用于神經(jīng)性疼痛、帶狀皰疹神經(jīng)痛、骨骼肌慢性痛、神經(jīng)性膀胱功能障礙、手術(shù)后惡心、手術(shù)后咽喉痛等疾病的治療。研究表明，辣椒堿對減重、多種癌癥（胰腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、肝細(xì)胞癌等）、心血管及胃腸道保護(hù)均有顯著影響。由于辣椒堿在水中的溶解性差、刺激性大且首過效應(yīng)明顯，將辣椒堿制備成不同的劑型以降低其副作用、減少刺激性、改變給藥途徑、方便患者使用等成為近年來研究的熱點。本試驗利用飽和水溶液法制備辣椒堿β-環(huán)糊精包合物，以包合率和包合物產(chǎn)率為評價指標(biāo)，通過對包合溫度、時間及配料比的考察，以響應(yīng)面法優(yōu)選其最佳工藝條件，以期對辣椒堿的制劑研究提供參考。

1.材料與方法

1.1試驗材料、試劑及儀器

辣椒堿（廣州五味源生物科技有限公司，純度≥98%）：甲醇（分析純，無錫市佳妮化工有限公司）；β-環(huán)糊精（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

UV-2450型紫外分光光度計（日本島津公司）：AL 104型電子天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）：HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）：KH-400KDV型高功率數(shù)控超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）：TJ270-30A型紅外分光光度計（天津市拓普儀器有限公司）。

1.2方法與步驟

1.2.1辣椒堿測定波長的選擇 稱取0.04 g辣椒堿于10mL容量瓶中，用甲醇將其溶解并定容，移取0.1 mL該溶液于10 mL容量瓶中用甲醇定容，配成終濃度為0.04 mg/mL的辣椒堿甲醇溶液，以甲醇作為空白對照，在200-400 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，其在230 nm和280 nm處有較大吸收，因考慮到230 nm處有末端吸收，所以選擇280 nm為辣椒堿的測定波長。

1.2.2辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與方法學(xué)研究

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：稱取0.02 g辣椒堿于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到貯備液。分別移取該貯備液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL到10 mL容量瓶中，用甲醇定容。以甲醇為空白對照，在280 nm處測定上述溶液的吸光度，平行測定3次。以吸光度（A）對質(zhì)量濃度（c）線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為A=0.14C+0.004 7，R2=0.999 4，線性范圍為16-56ug/mL。

2）精密度試驗：分別配制濃度為24、40、56ug/mL的辣椒堿甲醇溶液，進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度測定，以甲醇為空白對照，在280 nm波長處測定吸光度，計算實際濃度，日內(nèi)精密度每隔2 h測定一次，連續(xù)測3次，日間精密度連續(xù)測定3 d。

日內(nèi)精密度RSD分別為1.10%、1.05%和1.53%，日間精密度RSD分別為0.79%、1.10%和1.46%，均小于2.00%，表明該測定方法的精密度良好。

3）穩(wěn)定性試驗：配置40 ug/mL的辣椒堿甲醇溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、10 h，以甲醇為空白對照，在280 nm處測定其吸光度，RSD為0.31%，小于2.00%，表明辣椒堿甲醇溶液在室溫條件下放置10 h內(nèi)穩(wěn)定。

4）回收率的測定：精密稱取已知含量的辣椒堿B-CD包合物4 mg，共9份，分成3組，置于10 mL容量瓶中，分別加入0.4 mg/mL的辣椒堿儲備液1.2、1.6、2.0 mL，加甲醇振蕩溶解至刻度線，再吸取上述溶液0.4mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，以甲醇為空白對照，在280 nm處測定吸光度，測得平均加樣回收率為98.09%（95.00%<98.09%<105.00%），RSD為0.88%（<2.00%）。

1.2.3飽和水溶液法制備包合物 稱取足量的B-CD于150mL具塞錐形瓶中，加入20mL的蒸餾水，將其放入恒溫振蕩器中加熱振蕩，使B-CD充分溶解，過濾，制成B-CD飽和溶液，另外稱取適量辣椒堿于150 mL具塞錐形瓶中，用適量甲醇溶解，將B-CD飽和溶液緩慢加入到辣椒堿的甲醇溶液中，邊加邊振蕩，使溶液保持澄清，滴加完畢，將該溶液放入恒溫振蕩器中，2 h后取出，冷卻，冰箱冷藏24h，抽濾，于烘箱中干燥后即得辣椒堿B-CD包合物。

1.2.4包合物產(chǎn)率及包合率的測定 包合物產(chǎn)率的測定：將烘干后的包合物稱重，得到最終包合物質(zhì)量，按以下公式計算包合物產(chǎn)率：

包合物產(chǎn)率=包合物的質(zhì)量/（投入的辣椒堿質(zhì)量+投入的B-CD質(zhì)量）×100%

包合率的測定：稱取0.1 g包合物于10mL容量瓶中，加入適量甲醇，于超聲儀中超聲溶解，定容至10 mL，于280 nm處測定吸光度，按辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線及以下公式計算包合率：

包合率=包合物中辣椒堿質(zhì)量/投入的辣椒堿質(zhì)量×100%

1.2.5辣椒堿B-環(huán)糊精包合物的表征與鑒定 采用KBr壓片法，將B-CD、辣椒堿、辣椒堿和B-CD的混合物（1：1的摩爾比）以及辣椒堿B-CD包合物（1：1的摩爾比）的固體粉末分別在4 000～400 cm紅外光譜下掃描。

1.2.6響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇包合溫度、包合時間以及B-CD與辣椒堿的配料比（摩爾比，下同）作為研究參數(shù)，分別以A、B、C表示，以包合率及包合物產(chǎn)率為響應(yīng)值（Y1、Y2），采用Box-Benhnken試驗設(shè)計法對辣椒堿B-CD包合物的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，分析因素及水平編碼見表1。

2.結(jié)果與分析

2.1辣椒堿B-環(huán)糊精包合物的制備工藝

2.1.1響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果 以包合溫度、包合時間以及B-CD與辣椒堿的配料比為因素，以包合率及包合物產(chǎn)率為響應(yīng)值（Y1、Y2），采用BoxBenhnken試驗設(shè)計法對辣椒堿B-CD包合物的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗方案及結(jié)果見表2。對表2中的包合率和包合物產(chǎn)率進(jìn)行多元回歸擬合，獲得包合率對編碼自變量（包合時間、包合溫度、配料比）的二次多項回歸方程為：Y1=52.51+0.15A-0.049B+0.085C+0.032AB+0.38AC+0.26BC-3.90A²-2.49B²2.87C²。包合物產(chǎn)率的二次多項回歸方程為：Y2=53.96+0.5A-0.13B-0.046C-0.05AB+0.13A C+0.21BC-3.28A²-2.62B²-2.37C²。

包合率及包合物產(chǎn)率二次多項回歸模型方差分析結(jié)果見表3和表4。由表3和表4可以看出，辣椒堿B-CD包合物制備的模型中A2、B2、C2二次項對試驗結(jié)果的影響極顯著（P<0.001）?；貧w模型的相關(guān)系數(shù)R2=111.26/114.72=96.98%，方差分析數(shù)據(jù)說明該回歸方程對實際情況擬合較好。

2.1.2辣椒堿包合物產(chǎn)率及包合率的響應(yīng)面分析包合溫度、包合時間以及B-CD與辣椒堿的配料比三因素對辣椒堿包合物產(chǎn)率及包合率的交互影響的三維曲面圖如圖1、圖2、圖3所示。由各因素交互影響的三維曲面圖分析可得，3個響應(yīng)曲面圖均為開口向下的凸形曲面，響應(yīng)值Y1、Y2隨著每個因素變化而變化。比較3個不同的因素對響應(yīng)值Y1、Y2的影響，包合溫度對試驗結(jié)果的影響較顯著，其次是包合時間和配料比，與方差分析結(jié)果一致。

通過軟件分析最佳包合條件為包合溫度50.46℃，包合時間2.98 h，配料比1：1，得到理論包合率為52.506 6%，包合物的產(chǎn)率為53.973 0%。根據(jù)試驗條件對擬合的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到包合溫度為50℃，包合時間為3 h，配料比為1：1。

2.1.3模型驗證試驗 考慮到儀器條件及試驗操作的可控性，對上述最佳試驗條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)男拚蠝囟葹?1℃，包合時間為3 h，配料比為1：1時，進(jìn)行3組平行試驗，實際測得的辣椒堿包合物的平均產(chǎn)率及包合率分別為52.51%、53.93%，與理論值較為接近。

2.2紅外光譜法驗證包合物

從圖4中可以看出，辣椒堿在3 503、3 274、1 272、808 cm^-1等處都有吸收峰；B-CD在3 379 cm^-1處有一寬峰，在1 635、1 466、941、752 cm^-1等處有吸收峰；在包合物中，辣椒堿在3503、3274、808 cm-1等處的吸收峰消失，與混合物及B-CD的紅外光譜圖比較，辣椒堿與B-CD已形成包合物。

3.小結(jié)

本研究通過Design Expert軟件，將響應(yīng)面法應(yīng)用到辣椒堿B-環(huán)糊精包合物的制備工藝中。優(yōu)化后的包合工藝參數(shù)為包合溫度51℃，包合時間3 h，配料比1：1，在此條件下，辣椒堿包合物的平均產(chǎn)率及平均包合率分別為52.51%、53.93%。經(jīng)紅外光譜法鑒定，成功制備了辣椒堿B-環(huán)糊精包合物，提高了辣椒堿的水溶性，為辣椒堿新劑型的開發(fā)及應(yīng)用提供了參考。