蘿卜游離小孢子成胚誘導(dǎo)影響因素研究進展

李曉梅 冉茂林 楊峰

摘 要：綜述了影響蘿卜小孢子培養(yǎng)中胚狀體發(fā)生的主要因素，包括基因型、小孢子發(fā)育時期、小孢子的處理方式、培養(yǎng)基類型及其添加物等，同時提出了該技術(shù)存在的問題，并展望了這項技術(shù)在研究和生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：蘿卜；游離小孢子培養(yǎng)； 胚狀體誘導(dǎo)；影響因素

中圖分類號：S631.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-3547（2016）14-0041-04

蘿卜（Raphanus sativus L.）為十字花科蘿卜屬的一二年生草本植物，以肥大肉質(zhì)根為產(chǎn)品器官，是我國重要的蔬菜作物。異花授粉作物的雜種優(yōu)勢明顯，在蘿卜雜交優(yōu)勢育種中，人們多利用雄性不育系與自交系所產(chǎn)生的F1代的雜種優(yōu)勢來提高其品質(zhì)、產(chǎn)量和抗病性。遺傳性穩(wěn)定的純合自交系是必不可少的親本材料，常規(guī)選育方法獲得一個穩(wěn)定、純合的自交系一般需要7～8代，費工費時，且長期自交還會出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。而運用游離小孢子培養(yǎng)獲得純系是一種行之有效的方法，運用該技術(shù)可在2 a內(nèi)獲得遺傳穩(wěn)定的雙單倍體（Doubled haploid，DH）植株，從而大大縮短育種周期，提高育種效率。同時由于隱性性狀能在DH植株上直接表達，可提高優(yōu)異重組體與突變體的選擇效率，除此之外DH植株還可用于遺傳圖譜的構(gòu)建與分子標(biāo)記等基礎(chǔ)研究，小孢子和小孢子胚也是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，因此小孢子游離培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用前景廣闊[1]。

1989年，Lichter[2]首次通過小孢子培養(yǎng)技術(shù)成功獲得蘿卜胚狀體。此后，國內(nèi)外諸多學(xué)者對蘿卜游離小孢子技術(shù)開展了系統(tǒng)的研究。本文對20多a來國內(nèi)外有關(guān)蘿卜游離小孢子培養(yǎng)所取得的成果及其影響因素進行綜述，并以此提出蘿卜小孢子培養(yǎng)中現(xiàn)存的問題以及對未來的展望。

1 影響蘿卜小孢子成胚誘導(dǎo)的內(nèi)在因素

1.1 供體材料的基因型

供體植株的基因型是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，是小孢子胚胎發(fā)生起動與否的內(nèi)在因素，且不同基因型之間小孢子胚胎的發(fā)生頻率存在顯著差異。1996年，Takahata等[3]對11份蘿卜材料進行游離小孢子培養(yǎng)，其中只有6份材料獲得了胚狀體，其基因型發(fā)生范圍為54.5%，胚胎發(fā)生率為0.2～8.3個/105個游離小孢子。隨后張麗[4]用20個不同類型蘿卜品種為試材，進行游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)初步研究，發(fā)現(xiàn)只有山東板葉心里美1個品種能夠形成胚，陳文輝等[5]、周志國等[6]、張振超[7]的研究同樣證實了不同基因型蘿卜胚狀體發(fā)生率間存在顯著差異。王春麗等[8]進一步研究發(fā)現(xiàn)，在22份蘿卜材料中，有12份材料獲得了胚狀體，出胚材料中90%以上為雜種一代，表明蘿卜雜種一代較常規(guī)品種易出胚，這與趙艷玲[9]的研究結(jié)果一致，可能的原因是蘿卜胚胎發(fā)生能力同其他被證實了的十字花科作物一樣，是受染色體上某些基因位點控制，因而表現(xiàn)出較強的雜種優(yōu)勢。

1.2 小孢子發(fā)育時期

大多數(shù)植物小孢子培養(yǎng)的最佳時期為單核靠邊期至雙核早期，然而小孢子的發(fā)育時期與花蕾形態(tài)指標(biāo)相關(guān)?；ɡ匍L度是最早用于判定蘿卜小孢子發(fā)育時期的外在標(biāo)準(zhǔn)。Takahata等[3]發(fā)現(xiàn)蘿卜材料Chugoku-ao、Sushirazu-shogoin及Minikon的花蕾長度分別為3～4 mm、5～6 mm、4～5 mm時，其小孢子處于單核靠邊期至雙核早期，此時培養(yǎng)的小孢子胚狀體誘導(dǎo)率最高；周志國等[6]、龍雯虹[10]同樣證實，不同基因型的小孢子處于單核靠邊期至雙核早期的花蕾長度不同。李丹等[11]以4份不同蘿卜材料為試材，研究了花蕾不同形態(tài)指標(biāo)與小孢子發(fā)育時期的關(guān)系，結(jié)果表明不同材料花蕾縱徑、花蕾橫徑、花瓣長、花藥長存在極顯著差異，試驗材料處于單核靠邊期時的花蕾縱徑變幅為2.99～3.51 mm，橫徑為2.11～2.49 mm，花蕾縱橫徑比為1.41～1.48，花藥長度為2.05～2.51 mm，花藥寬度為0.83～0.95 mm，花瓣長度為1.89～2.56 mm，瓣藥比為0.92～1.06，相比較而言，小孢子發(fā)育適期瓣藥比在不同材料間的差異相對較小，更適合作為不同材料取樣適期的鑒定指標(biāo)和尺度，這與趙艷玲[9]的研究結(jié)果一致。Changhoo等[12]的研究表明，不同蘿卜品種小孢子培養(yǎng)最佳花蕾長度在2.5～6.5 mm，但其總體特征是當(dāng)花瓣約短于柱頭長度時小孢子處于單核晚期的比例最大。雖然花蕾形態(tài)可作為判斷小孢子發(fā)育時期的指標(biāo)，但它隨著供體植株基因型、生長條件、生長時間、花序等的變化而變化，故在每次培養(yǎng)前，應(yīng)對小孢子發(fā)育時期進行鑒定。

2 影響蘿卜游離小孢子成胚誘導(dǎo)的外因

2.1 材料的處理

在進行小孢子培養(yǎng)時對其進行處理，可改變小孢子的生理狀態(tài)，使分裂方式和發(fā)育途徑發(fā)生變化，促進胚狀體的形成，提高胚狀體發(fā)生率，這項措施在諸多植物上取得了成功。應(yīng)用在蘿卜小孢子培養(yǎng)中的處理方式主要有低溫、熱激、饑餓脅迫、添加甘露醇與秋水仙素等方法。

①低溫預(yù)處理 據(jù)許多研究者報道，低溫處理可改變花粉第2次有絲分裂的軸向，使正常的不對稱的有絲分裂被破壞而進行對稱分裂，形成2個均等的細(xì)胞，從而向孢子體途徑發(fā)展。在進行小孢子培養(yǎng)之前，對花序上的花蕾進行低溫預(yù)處理，可提高胚狀體的誘導(dǎo)。陳文輝等[5]證明3℃低溫處理24 h可顯著提高材料胚誘導(dǎo)率，但隨著處理時間的延長，誘導(dǎo)率反而下降，超過48 h小孢子不發(fā)育。付傳翠等[13]則認(rèn)為，4℃低溫處理3 d可提高小孢子存活率，但隨著時間推遲其存活率下降。李丹[14]認(rèn)為不同基因型材料適宜的低溫處理時間不同，蘿卜小孢子低溫預(yù)處理的適宜時間為1～3 d，小孢子的存活率隨時間的延長呈下降趨勢。然而白小娟等[15]、王春麗等[8]則認(rèn)為單純的低溫處理對小孢子的發(fā)育沒有影響。

②高溫?zé)峒ぬ幚?自從Keller等[16]在甘藍型油菜花藥培養(yǎng)中，首次用高溫處理提高花粉胚的誘導(dǎo)率獲得成功后，該方法被廣泛應(yīng)用于植物游離小孢子培養(yǎng)中。其作用機理可能是高溫處理改變了小孢子發(fā)育途徑，阻止小孢子向成熟花粉粒方向發(fā)展，從而促進其由配子體發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)樾℃咦芋w發(fā)育而誘導(dǎo)胚的形成。Takahata等[3]首次研究表明，32.5℃高溫處理是蘿卜小孢子胚狀體發(fā)生的必須條件，但其最佳時間隨著基因型變化而變化。趙艷玲[9]對3個蘿卜材料用32.5℃高溫?zé)峒ぬ幚恚?、24、48、72、96 h）后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)3種基因型熱激0、96 h時小孢子存活率和胚狀體誘導(dǎo)率全是0，說明小孢子沒有經(jīng)過高溫?zé)峒ぞ筒荒芘虼筮M而啟動分裂，而熱激96 h后的小孢子可能經(jīng)過長時間的高溫已經(jīng)死亡，當(dāng)小孢子熱激48 h存活率和胚狀體誘導(dǎo)率與其他4個處理呈顯著差異。大量研究表明，高溫?zé)峒ぬ幚砜娠@著提高蘿卜小孢子成胚誘導(dǎo)率，甚至是誘導(dǎo)成胚的必要條件，其最佳處理溫度為32～33℃，最佳處理時間為24～48 h[5～8，10～12，15]。

③其他處理方式 在蘿卜小孢子培養(yǎng)中，見報道的除上述2種處理方式外，還有饑餓脅迫、添加甘露醇及秋水仙素等處理方式。付傳翠等[13]研究表明，饑餓處理反而會降低蘿卜小孢子成活率，甘露醇及秋水仙素處理能提高蘿卜小孢子存活率，在4份供試材料中3份最適甘露醇處理濃度為5 g/L，1份為15 g/L，而2份材料最適秋水仙素處理濃度為20 mg/L，另2份材料分別為5、10 mg/L。李丹[14]研究了不同濃度甘露醇及處理時間對4份蘿卜材料小孢子存活率的影響，結(jié)果在4份材料中，有1份材料對甘露醇不敏感，2份材料經(jīng)10、15 g/L 的甘露醇預(yù)處理后，可保持較好的存活率，還有1份材料經(jīng)10 g/L甘露醇處理后有較高的小孢子存活率，但是隨著處理時間的延長而下降，可見不同基因型蘿卜最佳甘露醇或秋水仙素處理濃度不同，這與白小娟等[15]的研究結(jié)果一致。

2.2 培養(yǎng)基類型及添加物

①基本培養(yǎng)基及蔗糖濃度 蘿卜游離小孢子成胚誘導(dǎo)培養(yǎng)中最常用的是NLN或1/2 NLN基本培養(yǎng)基，其主要特點是大量元素含量較低。陳文輝等[5]研究了NLN與1/2 NLN對蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)只有1/2 NLN培養(yǎng)基才能誘導(dǎo)蘿卜小孢子產(chǎn)生胚狀體，然而趙艷玲[9]則認(rèn)為NLN與

1/2 NLN均可很好地用于蘿卜游離小孢子成胚誘導(dǎo)。蔗糖是小孢子培養(yǎng)中的主要碳源，用來提供能量和維持細(xì)胞的滲透壓。有些學(xué)者認(rèn)為，高濃度蔗糖可維持小孢子的活力。目前，蘿卜游離小孢子培養(yǎng)中使用的蔗糖濃度一般為13%[4，6，14]，但陳文輝[5]認(rèn)為12%蔗糖濃度最適宜蘿卜游離小孢子培養(yǎng)，而Changhoo等[12]比較了1/2 NLN 添加不同濃度蔗糖（10%、13%、15%、20%）對蘿卜小孢子胚誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)低于10%無胚狀體產(chǎn)生，適宜成胚誘導(dǎo)的最優(yōu)蔗糖濃度為15%，其胚產(chǎn)量可達2.4個/蕾。

②激素 在培養(yǎng)基中，激素的成分對誘發(fā)細(xì)胞生長與分裂起重要作用，在蘿卜游離小孢子培養(yǎng)中，外源激素對胚形成和植株再生的影響至今沒有取得一致的結(jié)果。Lichter[2]最早報道，在培養(yǎng)基中除去植物生長調(diào)節(jié)劑可提高胚產(chǎn)量。周志國等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在蘿卜小孢子培養(yǎng)中添加6-BA可明顯促進蘿卜游離小孢子胚狀體的誘導(dǎo)，當(dāng)濃度為0.1 mg/L時胚產(chǎn)量最高，但畸形胚發(fā)生率增加，這與趙艷玲[9]的研究結(jié)果一致。李丹[14]則認(rèn)為添加0.1 mg/L

6-BA+1 mg/L NAA為蘿卜小孢子成胚誘導(dǎo)的最佳激素組合。在實際工作中，大多數(shù)均采用不添加激素的培養(yǎng)方式。

③活性炭和硝酸銀 在小孢子離體培養(yǎng)中，無胚胎發(fā)生能力的小孢子能釋放出一些有毒物質(zhì)，可能會抑制具有胚胎發(fā)生能力小孢子的胚胎發(fā)生及胚狀體的正常發(fā)育，因此，在小孢子離體培養(yǎng)中常常會添加一些抑制劑來阻止有害物質(zhì)的影響，常用的添加物為活性炭和硝酸銀。Lichter[2]指出，活性炭不僅可以吸附培養(yǎng)基中有毒物質(zhì)，還可以吸附一些必要元素和植物激素，因此，活性炭的濃度不宜太高，否則會起負(fù)作用。周志國等[6]認(rèn)為，添加活性炭可提早出胚時間3～5 d，當(dāng)加入活性炭濃度為0.8 g/L 時，胚誘導(dǎo)率最高。趙艷玲[9]的研究表明，活性炭最適添加濃度為0.75 g/L，王康[17]研究表明活性炭最適添加濃度為0.1 g/L，張麗等[18]則認(rèn)為單純添加0.1 g/L活性炭對春白蘿卜離體小孢子成胚沒有明顯的促進作用，需要與4℃低溫處理相結(jié)合才能促進胚狀體的發(fā)生。硝酸銀為乙烯抑制劑，Changhoo等[12]比較了不同濃度硝酸銀對蘿卜游離小孢子培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)0.05 mg/L 硝酸銀為最適濃度，其胚產(chǎn)量為不添加硝酸銀的2倍多，但濃度超過1.0 mg/L后則無胚狀體產(chǎn)生。王康[17]研究發(fā)現(xiàn)，添加1～2 mg/L 硝酸銀可提高一些基因型的胚狀體發(fā)生頻率，而且在胚狀體誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生次生胚的過程中，硝酸銀的添加對次生胚的誘導(dǎo)也起到了一定的促進作用。

3 存在的問題與展望

蘿卜游離小孢子培養(yǎng)研究雖然取得了一定進展，但相對于其他十字花科作物而言其研究深度與廣度還差之甚遠(yuǎn)。蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)難點主要表現(xiàn)為成胚誘導(dǎo)能力基因型限制性強、小孢子成胚誘導(dǎo)頻率低以及培養(yǎng)結(jié)果重復(fù)性差等。現(xiàn)已證實小孢子胚胎發(fā)生能力同其他遺傳性狀一樣，是一種受基因調(diào)控的遺傳特性[19，20]，因此，可利用品種雜交的手段，將控制高胚胎發(fā)生能力的遺傳因子導(dǎo)入到無胚胎或低胚胎發(fā)生能力的基因型中，通過遺傳改良的方法擴大蘿卜小孢子胚胎發(fā)生的基因型范圍。同時通過優(yōu)化小孢子培養(yǎng)的各種因素建立完善、高效的再生體系，并使之與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用到育種工作中將是以后研究的重點。另外，應(yīng)逐步擴大蘿卜游離小孢子技術(shù)的應(yīng)用范圍，將該技術(shù)應(yīng)用于蘿卜種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳轉(zhuǎn)化、分子標(biāo)記、遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。我們相信，蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)不僅會成為常規(guī)育種的一個重要組成部分，而且必將在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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