應(yīng)用熒光聚合酶鏈式反應(yīng)檢測冷凍羊肉卷中羊肉的含量

顧文佳 徐瓊 張奕南 張清平 曲勤鳳

摘 要：目的：探索應(yīng)用熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法檢測冷凍羊肉卷中羊肉含量。方法：以羊線粒體細胞色素B基因為羊特異性基因，線粒體12S rRNA為內(nèi)參基因，應(yīng)用ΔCt法對羊肉含量進行相對定量，并與稱重法進行比較，分析基因拷貝數(shù)和羊肉脂肪含量對定量結(jié)果的影響。結(jié)果：熒光PCR法建立的標準曲線在羊肉含量為1%～100%時具有良好的線性關(guān)系（R2=0.990 1）。檢測7 個市售冷凍羊肉卷樣品，熒光PCR方法檢測出的羊肉含量與稱重法羊肉含量的相關(guān)系數(shù)為0.945 0（P<0.001），平均絕對差異為-11.0%，95%可信區(qū)間為（-7.4%，-14.6%）?；蚩截悢?shù)不同和羊肉脂肪含量不同對內(nèi)參基因擴增Ct值影響沒有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.072和0.206）。結(jié)論：熒光PCR法可用于快速檢測冷凍羊肉卷中羊肉成分的相對定量。

關(guān)鍵詞：熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)；定量檢測；羊肉

Application of Real-Time Fluorescence Polymerase Chain Reaction （PCR） for Quantitative Detection of

Lamb in Frozen Lamb Rolls

GU Wenjia， XU Qiong， ZHANG Yinan， ZHANG Qingping， QU Qinfeng

（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research， Shanghai 200233， China）

Abstract： Objective： To establish a real-time PCR method for quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls. Methods： The ovine mitochondrial cytochrome b gene （Cyt b） as species-specific primer and the mitochondrial 12S rRNA as endogenous control were selected to conduct relative quantification through ΔCt vs. lamb content （%）. The results obtained were compared with those from the weighing method. Some factors that may affect the quantitative results including the number of gene copies and fat content in lamb were also analyzed. Results： A high correlation coefficient （R2 = 0.990 1） was showed between ΔCt and lamb content in the range of 1%–100%. The correlation between the results of real-time PCR and weighting method for seven marketed samples of frozen lamb rolls was statistically significant （R2 = 0.945， P < 0.001）， and the average absolute difference was ?11.0% （with a 95% confidence interval of ?7.4% to ?14.6%）. The effects of the number of gene copies and fat content in lamb on the quantitative detection were not statistically significant （P = 0.072， and P = 0.206， respectively）. Conclusion： The real-time PCR method can be used as a quick and practical method in quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls.

Key words： real-time polymerase chain reaction； quantitative detection； lamb

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006

中圖分類號：TS251. 7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2016）07-0026-04

引文格式：

顧文佳， 徐瓊， 張奕南， 等. 應(yīng)用熒光聚合酶鏈式反應(yīng)檢測冷凍羊肉卷中羊肉的含量[J]. 肉類研究， 2016， 30（7）： 26-29. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

GU Wenjia， XU Qiong， ZHANG Yinan， et al. Application of real-time fluorescence polymerase chain reaction （pcr） for quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls[J]. Meat Research， 2016， 30（7）： 26-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

羊肉中夾雜其他肉類的“混合羊肉卷”在市場中出售不但存在以次充好的問題，還因混雜來源不明肉類存在重大的安全隱患[1-2]。常見的混雜方式是羊肉中混合鴨肉或豬肉，加入羊尾油，添上羊肋骨間的脂肪，凍成肉柱，作為冷凍羊肉卷出售。雖然一些摻假的羊肉被壓緊切片后，肥瘦相間的部位紅白分明、界限清晰，而真羊肉的肌間脂肪紋路搭配自然合理，相互滲透，以此作為真假羊肉卷鑒別的依據(jù)，尚缺乏客觀、定量的標準。

在肉類摻假鑒別方法中，最常見的方法為核酸分析法，包括聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[3-4]、限制性片段長度多態(tài)性PCR（PCR-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析[5-6]、測序法等[7-8]。熒光定量PCR方法靈敏、快捷，被廣泛用于肉類成分鑒別研究中，并已作為標準方法在國內(nèi)外推廣[9-11]。當檢測目標肉制品中含有其他物種時，熒光PCR法能夠快速直接給出定性結(jié)果[12-15]；但是進一步定量檢測混合肉制品中某種肉含量時，情況則復(fù)雜得多。盡管熒光PCR方法的定量結(jié)果影響因素很多，但因其方法靈敏、迅速，受到許多國內(nèi)外學者青睞，研究探討將其用于摻假肉制品定量檢測的靈敏性和準確性[16-17]。

本研究應(yīng)用熒光PCR方法推測冷凍羊肉卷中羊肉成分的質(zhì)量比，通過與稱重法比較，驗證該方法的準確性和可行性，并對基因拷貝數(shù)和羊肉脂肪含量等影響定量結(jié)果的因素進行分析，為推廣熒光PCR方法定量檢測羊肉成分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用羊肉、鴨肉、豬肉為本實驗室收集樣品，冷凍羊肉卷購自批發(fā)市場，樣品經(jīng)解凍后稱質(zhì)量、取樣。

DNA提取試劑盒（11796828001） 羅氏公司；PCR預(yù)混液Premix Ex Taq?（RR390） 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7500fast熒光定量PCR儀 美國ABI公司；6870冷凍研磨機 美國SPEX Sample Prep公司；6131生物分光光度計、5415R離心機 德國Eppendorf公司；AL204分析天平（感量0.1 mg） 瑞士Mettle-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

稱取50 mg樣品，按照試劑盒說明“組織中DNA的提取”進行。在50 mg組織中加入200 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，55 ℃水浴1 h，加入200 μL結(jié)合液，混勻，70 ℃放置10 min，加入100 μL異丙醇，混勻，移入離心柱中，離心，洗滌2 次，用100 μL稀釋液重懸DNA，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物及探針

引物及探針由上海英俊生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列見表1。

1.3.3 熒光定量PCR擴增體系及條件

熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含DNA模板1 μL，Real Time PCR預(yù)混液10 μL，Rox 0.4 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.4 μL，探針（10 mmol/L）0.6 μL，以超純水補足體積。

熒光定量PCR儀反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，40 個循環(huán)。使用ROX染料對熒光數(shù)值進行校正。

1.3.4 內(nèi)校準系統(tǒng)的建立

選擇線粒體基因12S rRNA作為內(nèi)校準基因，分別稱取相同質(zhì)量的羊肉、鴨肉和豬肉各6 份，采取1.3.1節(jié)的方法進行DNA的提取，使用熒光定量PCR儀測定內(nèi)參基因。比較所獲得的Ct值之間的差異。

1.3.5 不同羊肉脂肪含量的比較

將羊肌肉組織與羊脂肪分別按照質(zhì)量比3∶1、1∶1、1∶3混合，制成羊肌肉組織含量為25%、50%、75%和100%的4 份樣品。按照1.3.1節(jié)的方法進行DNA的提取，使用熒光定量PCR儀測定羊特異性基因和內(nèi)參基因，比較4 組之間Ct值的差異。

1.3.6 標準曲線的建立[19]

將新鮮羊肌肉組織和鴨肌肉組織按比例充分混勻，制成羊肉質(zhì)量百分比分別為100%、50%、20%、10%、5%和1%的羊-鴨混合肉標準品，每組4 個平行，采取1.3.1節(jié)的方法進行DNA的提取，使用熒光定量PCR儀分別測定羊特異性基因（細胞色素B（cytochrome b，Cytb））和內(nèi)參基因（12S rRNA）。根據(jù)所獲得的Ct值，按照式（1）計算。

ΔCt=CtCytb-Ct12S rRNA （1）

以ΔCt為縱坐標，標準品中羊肉百分比的對數(shù)值為橫坐標建立標準曲線。

1.3.7 市售樣品的稱重法檢測

冷凍羊肉卷完全解凍后，將所有可剝離的肉塊單獨標記，逐塊稱質(zhì)量，沖洗表面的血水后從組織中間取樣約50 mg，采取1.3.1節(jié)的方法進行DNA的提取，使用熒光定量PCR儀測定羊特異性基因，做出定性判定。羊肉卷中羊肉的質(zhì)量百分比按式（2）計算。

（2）

1.3.8 市售樣品的熒光PCR法檢測

隨機選取冷凍羊肉卷的不同部位，充分粉碎混合，提取DNA并PCR擴增后，將其熒光PCR擴增所得的ΔCt值帶入1.3.6節(jié)的標準曲線，由此得出市售羊肉卷中羊肉成分質(zhì)量百分比。并與稱重法結(jié)果進行對比，驗證定量方法的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)校準系統(tǒng)

本實驗設(shè)計了雙重熒光PCR反應(yīng)，即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時擴增目標基因和內(nèi)參基因，根據(jù)兩者Ct值之差得出起始DNA中模板濃度的差異，進而推斷出不同動物的質(zhì)量比。為了校準不同動物之間細胞大小、線粒體基因拷貝數(shù)不同，分別稱取相同質(zhì)量的羊肉、鴨肉和豬肉各6 份，提取DNA后調(diào)整模板DNA質(zhì)量濃度至

50 ng/μL，得到內(nèi)參基因Ct值為羊肉15.72±0.35、鴨肉15.96±0.48、豬肉16.24±0.49，各組之間差異無統(tǒng)計學意義（F=2.969，P=0.072）。且將DNA模板10 倍系列稀釋后，以Ct值為縱軸，模板DNA稀釋倍數(shù)為橫軸得到的回歸方程斜率接近。本次實驗相同質(zhì)量羊肉、鴨肉和豬肉之間內(nèi)參基因表達無差異，可以用作后續(xù)雙重熒光PCR的內(nèi)參照。

2.2 羊肉脂肪的影響

將羊肌肉組織與羊腹部脂肪按一定比例混合，制成羊脂肪含量為0%、25%、50%、75%的4 份樣品，提取DNA后調(diào)整模板DNA質(zhì)量濃度至50 ng/μL，測定羊特異性基因和內(nèi)參基因Ct值，結(jié)果如表2所示。各組之間差異無統(tǒng)計學意義（F=1.774，P=0.206）。

2.3 標準曲線的建立

將新鮮羊肌肉組織和鴨肌肉組織按比例充分混勻，制成羊肉質(zhì)量百分比分別為100%、50%、20%、10%、5%和1%的羊-鴨混合肉標準品，使用熒光定量PCR儀分別測定羊特異性基因（Cytb）和內(nèi)參基因（12S rRNA）。根據(jù)所獲得的Ct值，按照公式計算ΔCt。以ΔCt為縱坐標，標準品中羊肉質(zhì)量百分比的對數(shù)值為橫坐標建立標準曲線，得到線性方程為y=-4.501 9x+9.458 8，R?=0.990 1。

2.4 市售冷凍羊肉卷的定量檢測

將購入的摻假冷凍羊肉卷按照稱重法和熒光PCR法同時檢測羊肉含量，結(jié)果見表3。熒光PCR方法檢測出的羊肉含量與稱重法羊肉含量的相關(guān)系數(shù)為0.945 0，

P<0.001說明兩者相關(guān)性極高。熒光PCR方法檢測出的羊肉含量與稱重法結(jié)果比較平均，絕對差異為-11.0%，95%可信區(qū)間為（-7.4%，-14.6%）。

3 討 論

定量檢測混合肉類中各組分的質(zhì)量比一直是肉類檢測中的一個難點[20]。熒光PCR方法靈敏、迅速，有許多研究探討將其用于摻假肉制品定量檢測的可行性。本研究通過熒光PCR法檢測冷凍羊肉卷中羊肉成分質(zhì)量比，得出市售冷凍羊肉卷中羊肉含量為8.5%～35.6%。并與稱重法比較，發(fā)現(xiàn)2 種方法檢測結(jié)果相關(guān)性較高（r=0.945 0，P<0.001），在實際工作中可作為一個快速、簡便的肉類定量檢測的方法。

在應(yīng)用中，將定量PCR得到的DNA拷貝數(shù)直接換算成各個肉組分的質(zhì)量比會受到一些因素的影響[20-21]。首先，不同動物的細胞大小、染色體倍數(shù)、基因組大小、拷貝數(shù)等不同，會影響定量結(jié)果[21-22]；其次，未知肉的組成不同也會影響定量結(jié)果，相同質(zhì)量的不同組織中DNA含量從多到少依次為：腎、心、肝、肌肉、腦、皮[17]；再次，DNA的提取效率、PCR的擴增效率不同也會影響核酸定量的準確性[23]。建立含有內(nèi)參照系統(tǒng)的熒光定量PCR體系能夠盡可能地消除由DNA提取效率和PCR擴增效率引發(fā)的差異，從而得到更接近真實值的定量結(jié)果[24-25]。本研究使用了含有內(nèi)參照系統(tǒng)的雙重熒光PCR體系，經(jīng)實驗分析，相同質(zhì)量的羊、豬和鴨肉經(jīng)DNA提取和PCR擴增，不同基因拷貝數(shù)和羊肉脂肪含量對內(nèi)參基因擴增Ct值影響沒有統(tǒng)計學意義。因此該方法可得到較廣泛的應(yīng)用，樣本中脂肪含量、混雜的不同肉類成分對羊肉的定量結(jié)果影響不大。

混合肉類定量結(jié)果在同一實驗室、使用同一樣本制作標準曲線和盲樣時，定量結(jié)果通常非常準確[26-28]。當遇到實際樣本或者成分更多的混合肉制品時，熒光PCR的定量結(jié)果與實際結(jié)果會有較大差異[4，29-30]。周彤等[4]通過含豬源性成分的模擬混合肉樣檢測，樣品豬源性成分含量的回收率平均值為122.27%。K?ppel等[29]則發(fā)現(xiàn)經(jīng)過熒光PCR得出的定量結(jié)果與真值之間的誤差在±30%之內(nèi)。本研究熒光PCR法檢測得出的羊肉含量結(jié)果比稱重法偏低，平均差異為-11.0%，95%可信區(qū)間為（-7.4%，

-14.6%），與上述學者研究結(jié)果接近。應(yīng)用該方法進行羊肉卷中羊肉成分定量檢測時結(jié)果更趨于保守，產(chǎn)生這種差異可能的原因有待進一步研究。相對而言，稱重法在肉制品各個小組分能夠輕松分離、總數(shù)不多的情況下使用，如冷凍羊肉卷、羊肉串等，也是一個值得嘗試的有效而準確的方法。

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