決明子水提液對(duì)大鼠肝臟CYP450酶的影響

許龍龍 湯響林 馬增春 王宇光 梁乾德 譚洪玲 肖成榮 李樺 原梅 高月

[摘要]該文研究決明子水提液對(duì)大鼠肝臟CYP450酶酶活性、mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。取SD大鼠，口服灌胃受試藥物后，處死，用冰冷生理鹽水灌流肝臟，提取大鼠肝臟微粒體、肝臟總RNA和總蛋白，采用 Cocktail體外孵育法結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用（LCMS）技術(shù)對(duì)大鼠肝臟中CYP1A2，2B1，2C11，2D2，2E1，3A1各亞酶的酶活性進(jìn)行測(cè)定，并應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)和Western blot對(duì)上述亞型的 mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，酶活性方面，決明子水提液組與空白組比較可明顯誘導(dǎo)CYP1A2，2B1，2C11，2D2，2E1，3A1的酶活性，其中決明子低劑量組對(duì)CYP2D2有明顯的抑制作用，中、高劑量組對(duì)CYP2D2有明顯的誘導(dǎo)作用，且都呈劑量依賴性增加，但對(duì)CYP3A1的誘導(dǎo)不呈劑量依賴性；mRNA表達(dá)方面，決明子水提液對(duì)CYP1A2，2C11，2D2，2E1 mRNA的表達(dá)具有顯著誘導(dǎo)作用，其中對(duì)CYP1A2，2D2，2E1誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性，與酶活性水平具有一致性，對(duì)CYP2B1，3A1沒(méi)有明顯作用；蛋白表達(dá)方面，決明子水提液對(duì)CYP2C11，2E1的表達(dá)也具有誘導(dǎo)作用，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。決明子水提液對(duì)CYP450同工酶不同程度誘導(dǎo)或抑制作用，特別是對(duì)于CYP2C11，2E1亞型酶，酶活性與mRNA，蛋白表達(dá)水平具有一致性，提示當(dāng)與這些酶底物合并用藥時(shí)，尤其是與CYP2C11，2E1代謝有關(guān)的藥物合用時(shí)，應(yīng)充分考慮到潛在的有益和不利的藥物相互作用。

[關(guān)鍵詞]決明子；細(xì)胞色素P450酶；Cocktail探針?lè)ǎ粺晒舛縋CR技術(shù)；Western blot

[Abstract]To study the effect of aqueous extract of Cassiae Semen on the activity， mRNA and protein expressions of cytochrome P450（CYP450） system in rat liver microsomes， microsomes of rat liver were prepared after the oral administration with aqueous extract of Cassiae Semen for 14 days The enzyme activity was quantified by Cocktail method Meanwhile， the mRNA and protein expressions of CYP1A2， CYP2B1， CYP2C11， CYP2D2， CYP2E1 and CYP3A1 in the livers were detected by RTPCR and Western blot The result of this experiment was that aqueous extract of Cassiae Semen obviously induced the enzyme activities of CYP1A2， CYP2B1， CYP2C11， CYP2D2， CYP2E1 and CYP3A1 Low dose of aqueous extract of Cassiae Semen significantly reduced the activity of CYP2D2， but the activity of CYP2D2 was significantly induced by middle dose and high dose of aqueous extract of Cassiae Semen These subtypes were increased in a dosedependent manner except for CYP3A1 The mRNA levels of CYP1A2， CYP2C11， CYP2D2 and CYP2E1 were also induced in rats treated with aqueous extract of Cassiae Semen， but with no significant effect in CYP2B1 and CYP3A1 mRNA expressions The protein levels of CYP2C11 and CYP2E1 were also induced in rats treated with aqueous extract of Cassiae Semen， but with no significant difference Since the enzyme activity， mRNA and protein expressions of CYP450， particularly CYP2C11and2E1subtypes， were induced or inhibited by aqueous extract of Cassiae Semen to varing degrees， suggesting the potential drugdrug interactions should be concerned

[Key words]Cassiae Semen；cytochrome P450；Cocktail probe method；QPCR； Western blot

doi：10.4268/cjcmm20160823

決明子為豆科植物Cassia obtusifolia L或小決明C tora L的干燥成熟種子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品藥，為我國(guó)藥典收載的常用中藥[1]，其性味甘、苦、咸，微寒，歸肝、大腸經(jīng)，具清熱明目、利水通便的功效。決明子具有多種藥理作用，主治目赤澀痛、羞明多淚、頭痛、眩暈、小便不利、習(xí)慣性便秘等?，F(xiàn)代藥理研究證明決明子具有降血壓、降血脂、保肝、抗菌等活性，同時(shí)又可作為保健飲品的原料[2]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)決明子的研究主要集中在化學(xué)成分、保肝降脂機(jī)制[34]等研究，決明子作為傳統(tǒng)的中藥材，其一直既是食品又是藥品的物品，可以長(zhǎng)期使用，周宇紅等[5]研究決明子長(zhǎng)期服用，可引起腎、腸系膜淋巴結(jié)、睪丸等靶器官病理改變，提示決明子不宜長(zhǎng)期大量服用，因此決明子主要成分蒽醌衍生物的潛在不良反應(yīng)應(yīng)引起足夠的重視，而藥物相互作用是臨床上產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)甚至死亡的主要原因之一。細(xì)胞色素P450（cytochrome P450）作為人體重要I相藥物代謝酶系統(tǒng)，其對(duì)藥物代謝和藥物之間的相互作用有著重要影響[6]。在臨床應(yīng)用中，決明子與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，有發(fā)生藥物相互作用的可能，并由此改變相關(guān)藥物的血藥濃度，甚至引起不良反應(yīng)的發(fā)生。此前關(guān)于決明子對(duì)藥物代謝酶影響的研究相對(duì)較少，缺乏該藥物對(duì)藥物代謝酶影響的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的混合探針的測(cè)定方法，選擇了大鼠體內(nèi)相對(duì)應(yīng)的6種亞型進(jìn)行研究，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[7]測(cè)定了決明子水提液對(duì)大鼠CYP450亞酶酶活性的影響，同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)、Western blot對(duì)大鼠 CYP450同工酶mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，從3個(gè)層面發(fā)現(xiàn)了決明子水提液對(duì)藥物代謝酶亞型的影響，為臨床合理使用該藥提供參考[8]。

1材料

決明子購(gòu)自北京同仁堂，產(chǎn)地安徽，批號(hào)20150201，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所馬百平研究員鑒定；非那西丁/對(duì)乙酰氨基酚（phenacetin/paracetamol），甲苯磺丁脲/4羥基甲苯磺丁脲（tolbutamide/4hydroxytolbutamide），右美沙芬/右啡烷（dextromethorphan/dextrorphan），氯唑沙宗/6羥基氯唑沙宗（chlorzoxazone/6hydroxychlorzoxazone）均購(gòu)自Sigma 或 BD Genetest公司；安非他酮/4羥基安非他酮（bupropion/4hydroxybupropion），咪達(dá)唑侖/1羥基咪達(dá)唑侖（midazolam/1hydroxymidazolam）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；NADPH購(gòu)自瑞士Roche公司；超純總RNA快速提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)博邁德（Biomed）公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒及QPCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京全式金（TransGen）公司；甲醇和乙腈為色譜純，購(gòu)自美國(guó)SigmaAldrich公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

Agilent 1290型超高效液相色譜儀（UHPLC，美國(guó)Agilent公司）；Agilent 6410B型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Agilent ZORBAX EclipseC18色譜柱（21 mm×100 mm，35 μm，美國(guó)Agilent公司）；ImageQuant LAS 500顯影儀；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠）；SHBⅢA循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；Optima LXP超高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Beckman）；DY891勻漿機(jī)（中國(guó)寧波新芝生物科技有限公司）；Labofuge 400R高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Heraeus）；ABI Step One Plus 熒光定量PCR儀；BS223S電子天平（德國(guó)Sartorious公司）；pH計(jì)（METTLER TOLEDO）；QM20型制冰機(jī)；純水儀（Millipore Simplicity）。

雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重180～220 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK（軍）2015004，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（軍）2015004。動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組9只，分別為空白組，苯巴比妥組，決明子低劑量組、中劑量組、高劑量組。

2方法

21給藥方案

苯巴比妥組腹腔注射給予80 mg·kg-1·d-1苯巴比妥鈉，第12天開始注射，連續(xù)3 d，第15天制備肝微粒體；決明子低劑量組（15 g·kg-1·d-1，根據(jù)《中國(guó)藥典》，由人臨床劑量換算成大鼠等效劑量），決明子中劑量（5 g· kg-1·d-1，相當(dāng)于3倍人臨床劑量），決明子高劑量（15 g· kg-1·d-1，相當(dāng)于9倍人臨床劑量），連續(xù)灌胃14 d，第15天脫臼處死動(dòng)物制備肝微粒體；空白組給予等量生理鹽水，連續(xù)14 d，第15天制取肝微粒體。

22供試樣品的制備

決明子水提液的制備： 取決明子500 g，置圓底燒瓶中，加水4 000 mL浸沒(méi)藥材，浸泡30 min 后，加熱至煮沸，保持微沸60 min，分離煎出液，藥渣加水2 000 mL依法再次煎煮30 min，合并 2 次煎出液，放置于50 ℃ 水浴鍋中緩慢蒸發(fā)，濃縮至500 mL（按生藥算，質(zhì)量濃度相當(dāng)于1 g·mL-1），冷藏于4 ℃冰箱備用。

23Cocktail探針?lè)y(cè)定決明子水提液對(duì)大鼠肝臟CYP450酶活性水平的影響

231肝微粒體的制備各組大鼠給藥結(jié)束后，禁食12 h，脫臼處死，迅速打開腹腔和胸腔，用注射器以4 ℃生理鹽水由門靜脈灌洗，結(jié)扎上腔靜脈，灌洗至肝臟呈土黃色。將肝臟剪碎，按1∶4加入TMS緩沖液，冰浴中勻漿。勻漿液4 ℃，12 000×g離心20 min，棄沉淀。上清液4 ℃，105 000×g離心60 min，棄上清，沉淀部分即肝微粒體。按初始勻漿時(shí)每1 g肝組織加入1 mL TrisHCl儲(chǔ)存液（4 ℃），重懸微粒體，冰浴，玻璃勻漿器手動(dòng)研磨，使微粒體均勻分散。分裝微粒體，-80 ℃保存。采用康為公司的BCA法測(cè)定肝微粒體蛋白濃度，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

232肝微粒體孵育體系將肝微粒體與CYP450同工酶探針?biāo)幬锕餐跤瑴y(cè)定探針?biāo)幬锎x產(chǎn)物的生成量來(lái)反映決明子水提液對(duì)CYP450同工酶的誘導(dǎo)或抑制作用。孵育體系包括肝微粒體（05 g·L-1），NADPH（1 mmol·L-1），CYP特異性探針底物非那西?。?0 μmol·L-1）、甲苯磺丁脲（25 μmol·L-1）、安非他酮（25 μmol·L-1）、右美沙芬（5 μmol·L-1）、氯唑沙宗（25 μmol·L-1）和咪達(dá)唑侖（25 μmol·L-1），K2HPO4/KH2PO4緩沖液（005 μmol·L-1，pH 74）補(bǔ)足體系至200 μL。37 ℃水浴預(yù)孵育5 min后加入同樣預(yù)孵育5 min的NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴溫孵育30 min，加入200 μL預(yù)冷的終止劑（普萘洛爾100 μg·L-1，大黃素1 μmol·L-1，溶劑為甲醇乙腈1∶1）終止反應(yīng)?；鞈? min后，4 ℃，13 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣定量分析各底物的代謝產(chǎn)物生成率，測(cè)得酶活性。

決明子水提液中、高劑量組可明顯誘導(dǎo)CYP1A2，2B1，2C11，2D2，2E1和3A1酶活性，在mRNA水平對(duì)CYP1A2，2C11，2D2，2E1 mRNA的表達(dá)具有顯著上調(diào)作用，因此選擇了CYP2C11，2E1進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。分析結(jié)果顯示決明子水提液僅對(duì)CYP2C11，2E1蛋白表達(dá)有誘導(dǎo)作用，見圖2。

4討論

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）又稱混合功能氧化酶和單加氧酶，為一類亞鐵血紅素硫醇鹽蛋白的超家族，是一種單鏈的B族細(xì)胞色素蛋白。在動(dòng)物、植物、微生物的各種組織中廣泛存在，包括許多同工酶，是微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶，主要存在于成人肝臟中，在內(nèi)源和外源化合物的代謝過(guò)程中有重要作用[9]。

中藥多組分和多靶點(diǎn)的特性決定了其作用機(jī)制的復(fù)雜性，對(duì)主要有效成分的酶活性評(píng)價(jià)可以為深入認(rèn)識(shí)中藥合理應(yīng)用及機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)[10]。一般而言，酶抑制作用所致的代謝性相互作用的臨床意義遠(yuǎn)大于酶促作用，約占該酶系統(tǒng)全部相互作用的70%。中藥有效成分對(duì) CYP450酶的抑制能降低合用的其他中藥成分或化學(xué)藥物的體內(nèi)代謝消除，打破合用藥物與其代謝產(chǎn)物之間的平衡，增高血藥濃度或引起蓄積，可能導(dǎo)致藥物的藥效增強(qiáng)乃至不良反應(yīng)或毒性反應(yīng)的發(fā)生。因此，評(píng)價(jià)中藥有效成分對(duì) CYP450 酶活性的影響，對(duì)于臨床安全用藥、降低藥物藥物相互作用[11]的風(fēng)險(xiǎn)有重要的意義。

本文就從藥物代謝酶的角度，主要對(duì)CYP各亞型在酶活性、mRNA和蛋白水平的影響進(jìn)行了研究和比較。本研究結(jié)果顯示，決明子水提液高劑量組對(duì)主要CYP酶的誘導(dǎo)作用最顯著，故初步推測(cè)決明子具有肝藥酶誘導(dǎo)作用，可與一些治療窗口比較窄、有明顯毒副作用的藥物合用，可加快其代謝反應(yīng)，緩解臨床不良反應(yīng)[12]。大鼠CYP1A2酶與人類CYP1A2酶同源，CYP1A2主要存在于肝臟中，約占肝臟CYP酶總量的13%，僅次于CYP3A和CYP2C亞家族，居肝臟各CYP酶含量的第3位[13]，臨床上，如茶堿、他克林、硝苯地平等多環(huán)芳烴類致癌物以及咪唑喹啉派生物等20多種藥物經(jīng)CYP1A2酶代謝，決明子可以誘導(dǎo)CYP1A2的酶活性，加快藥物的代謝導(dǎo)致藥效降低，因此應(yīng)注意決明子與這些藥物之間可能的相互作用，尤其是對(duì)于治療窗窄的藥物，比如茶堿類，更應(yīng)注意使用劑量。大鼠CYP2B1酶與人類CYP2B6酶同源，CYP2B6參與代謝的臨床藥物如氯氨酮、非核苷類的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑依法韋侖等[14]，決明子誘導(dǎo)CYP2B6酶活性，能使某些藥物（代謝產(chǎn)物無(wú)活性）藥效降低，或產(chǎn)生耐藥；而另一些藥物（代謝產(chǎn)物有活性）在常規(guī)劑量下導(dǎo)致中毒。大鼠CYP2C11酶與人類CYP2C9酶同源，臨床上經(jīng)CYP2C9酶代謝的藥物有塞來(lái)考希昔、格列吡嗪、華法林等，當(dāng)決明子與CYP2C9的底物合用時(shí)[15]，這些底物在體內(nèi)代謝速率可能會(huì)加快，其中華法林是現(xiàn)在臨床上使用最廣泛的抗凝血藥，治療窗窄，決明子可能會(huì)使華法林血藥濃度降低，造成凝血危險(xiǎn)，因此在使用過(guò)程中應(yīng)注意觀察，合理使用安全劑量。大鼠CYP2D2酶與人類CYP2D6同源，CYP2D6含量雖比其他 CYP450 亞家族低，但參與了市場(chǎng)上20%～25%臨床藥物的代謝，包括精神安定藥、抗心律失常藥、鎮(zhèn)痛藥、抗抑郁藥、止吐藥以及一些抗癌藥等[16]，臨床上經(jīng)CYP2D6酶代謝的藥物有丙咪嗪、多柔比星、地塞米松等，推測(cè)決明子有可能加速這些藥物的體內(nèi)代謝。大鼠CYP2E1酶與人類CYP2E1同源，并且有很好的相關(guān)性，CYP2E1是一種非常重要的CYP450酶，它不僅參與了藥物代謝，而且能夠催化許多前致癌物質(zhì)和前毒物轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)和有毒物質(zhì)，還可催化大量的普通毒物的代謝，其中包括氯化的小分子有機(jī)化合物如四氯化碳、乙醇類、乙酰氨基苯等，決明子誘導(dǎo)CYP2E1可能會(huì)與CYP2E1前毒物類底物產(chǎn)生不利的藥物相互作用，誘導(dǎo)前毒物轉(zhuǎn)化為毒性物質(zhì)，加大不良反應(yīng)的發(fā)生幾率；決明子也可能會(huì)加速經(jīng)CYP2E1代謝的有毒藥物的代謝，生成沒(méi)有毒性的代謝產(chǎn)物[17]。大鼠CYP3A1酶與人類CYP3A4同源，臨床上經(jīng)CYP3A4酶代謝的藥物有阿托伐他汀、辛伐他汀、地高辛等，CYP3A4主要存在于人類的肝臟及腸道中，其中它在肝臟中占P450酶總量的25%左右，臨床中約有50%的藥物經(jīng)由CYP3A4酶代謝，CYP3A4為辛伐他汀的主要代謝酶之一，在調(diào)節(jié)血脂過(guò)程中，決明子可能會(huì)加速辛伐他汀的體內(nèi)代謝，應(yīng)進(jìn)行調(diào)整藥物用量，在藥效最大的同時(shí)將不良反應(yīng)降到最低限[18]。

決明子作為一種常用的中藥材，臨床上常與枸杞子、桑葚、紅花、山楂等中藥配伍，當(dāng)患者長(zhǎng)期服用含有決明子的中成藥和復(fù)方時(shí)，應(yīng)考慮到臨床上可能潛在的藥物相互作用，所以下一步研究會(huì)重點(diǎn)關(guān)注決明子與上述中藥配伍使用產(chǎn)生的相互作用，從整體去闡述其在機(jī)體內(nèi)的變化。決明子水提液對(duì)大鼠CYP450酶的研究表明，其臨床劑量對(duì)CYP450酶的整體影響較小，高劑量主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，臨床代謝性相互作用上屬于相對(duì)安全的藥物，這與其被列入既是藥品又是食品的物品相符。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化決明子給藥方案，能為合理選用同類藥品提供依據(jù)，避免具有臨床意義的藥物代謝性相互作用的發(fā)生，從而提高臨床用藥的有效性和安全性。此外，體外實(shí)驗(yàn)不能全面的反應(yīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。因此研究中藥藥理作用的分子機(jī)制，中藥間及中西藥間相互作用的機(jī)制、解釋中藥合理應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵還要進(jìn)行更加深入的研究[19]。由于CYP450存在一定的種屬差異性，雖然大鼠的CYP450亞型與人的接近程度較高，但并不能代替人的所有CYP450亞型代謝模式，因此，研究決明子對(duì)人體CYP450亞型酶活性的作用，仍需進(jìn)一步的人體試驗(yàn)。

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[責(zé)任編輯馬超一]