HPLC睤AD同時測定紅花中4種亞精胺成分

李石飛 袁茂葉 張立偉

[摘要]采用高效液相色譜（HPLC）的方法，以Agilent Zorbax Eclipse XDBC18（46 mm× 250 mm， 5 μm）為色譜分離柱，流動相為47%甲醇/水等度洗脫，洗脫流速為10 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長為270， 280， 290， 300 nm多波長檢測的色譜條件同時測定紅花中4種亞精胺成分N1， N5， N10（Z）tripcoumaroylspermidine （1）， N1， N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine （2）， N1（E）N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine （3）， 和N1， N5， N10（E）tripcoumaroylspermidine （4）的含量，進(jìn)樣體積為10 μL。各成分之間分離度良好，4種亞精胺成分的質(zhì)量濃度分別在0002 1～0041 6 （r=0999 5）， 0002 6～0051 2 （r=0999 7）， 0002 7～0054 0 （r=0999 8）， 0005 0～0100 4（r=0999 8） g·L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為 9861%～1009%，RSD為23%～30%。表明所建立的方法快速簡便、具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于紅花中4種亞精胺成分的含量測定。

[關(guān)鍵詞]紅花；HPLC；亞精胺成分

Simultaneous determination of four coumaroylspermidine constituents in

Carthamus tinctorius by HPLCDAD

LI Shifei， YUAN Maoye， ZHANG Liwei*

（Institute of Molecular Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

[Abstract]The HPLCDAD method was established to simultaneously determine the contents of four coumaroylspermidine[ N1， N5， N10（Z）tripcoumaroylspermidine （1）， N1， N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine （2）， N1（E）N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine （3）， and N1， N5， N10（E）tripcoumaroylspermidine （4） ] in Carthamus tinctorius The method was performed on an Eclipse XDBC18 column （46 mm×250 mm， 5 μm） eluted with 47% methanol in an isocratic program The flow rate was 1 mL·min-1； the injection volume was 10 μL， and the column temperature was 30 ℃ The detective wavelength was 270， 280， 290， and 300 nm， respectively Four coumaroylspermidine constituents showed a good linearity in the range of 0002 10041 6 （r=0999 5）， 0002 60051 2 （r=0999 7）， 0002 70054 0 （r=0999 8） g·L-1， and 0005 00100 4 （r=0999 8） g·L-1， respectively The average recoveries of these four coumaroylspermidine constituents were in the range of 9861%1009% （RSD 23%30%）. In conclusion， the method is simple， rapid， and sensitive， which could be used as a quantitative determination method for the four coumaroylspermidine components in Ctinctorius

[Key words]Carthamus tinctorius； HPLC； coumaroylspermidine constituents

doi：10.4268/cjcmm20160819

紅花是菊科紅花屬植物Carthamus tinctorius L的干燥管狀花，全國各地都有分布，主要產(chǎn)自于新疆、河南、四川、浙江等省份。紅花在我國已經(jīng)有2 500年的藥用歷史，具有活血通經(jīng)、降血壓、散瘀止痛和降血脂等功效。文獻(xiàn)報道的從紅花中分離得到的化學(xué)成分已經(jīng)有250多種，包括黃酮類[1]、生物堿類[2]、聚炔類[3]、烷基二醇類[45]、有機(jī)酸類[67]、甾體類[8]、亞精胺類[9]等。其中亞精胺類結(jié)構(gòu)是指具有H2N（CH2）3NH（CH2）4NH2結(jié)構(gòu)單元的多胺類化合物，這類成分顯示出了廣泛的生物活性，如抗HIV病毒[10]，抗腫瘤[11]，抗氧化[12]等。2009年中國科學(xué)院上海生科院研究人員采用活性追蹤的方法從紅花分離得到了亞精胺類化合物N1，N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine，并采用細(xì)胞培養(yǎng)法，大鼠腦突觸體5羥色胺（5HT）再攝取抑制方法以及體內(nèi)實驗法研究了該化合物抑制5HT再攝取的活性，結(jié)果表明亞精胺類化合物N1，N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine對5HT再攝取有很好的選擇性抑制活性[13]。之后，2013年中國科學(xué)院西北高原生物研究所研究人員采用高速逆流色譜技術(shù)對紅花中的這類亞精胺成分進(jìn)行了快速制備研究[14]?？梢?，紅花中的這類亞精胺成分應(yīng)該在紅花功效應(yīng)該起到了重要作用，然而目前有關(guān)這類成分的分析和檢測目前還未見報道，因此為了制定這類物質(zhì)快速檢測方法，也為了提高紅花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需要建立一個可靠、準(zhǔn)確的分析方法來對該類進(jìn)行同時測定。

本研究建立了HPLCDAD同時測定紅花種4種亞精胺成分，并對產(chǎn)自新疆、云南、河南的紅花藥材進(jìn)行了4種亞精胺成分的含量測定，可為紅花藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

Agilent 1200 系列 HPLC 儀，包括 G1311A四元泵，G1322A脫氣機(jī)，G1316A柱溫箱，手動進(jìn)樣器，G1315DDAD 檢測器，HPRev B0302化學(xué)工作站，美國安捷倫公司；CHEETAHTM中壓快速制備色譜；柱層析硅膠（100200目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH20（瑞典 GE 公司）；島津 LC6AD型制備液相；Venusil XBP C18制備柱（212 mm×250 mm，5 μm）；Bruker 600MHz AVANCE NMR Spectrometer（60013 MHz proton frequency）；SB3200 DTS超聲波掃頻清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司； BSA124S型1/1萬電子天平，德國sartorius公司。

實驗中所用甲醇和乙腈均為色譜純（美國Fisher Scientific公司），所用水均為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），所用試劑均為分析純（天津北辰化學(xué)試劑廠）。

實驗中所用紅花均采自新疆，由山西華衛(wèi)藥業(yè)有限公司提供，所有樣品經(jīng)山西大學(xué)張立偉教授鑒定為菊科植物紅花C tinctorius的干燥管狀花，樣品含量測定中的云南和河南紅花藥材均采購于山西藥店。本實驗中所用4種亞精胺成分均由實驗室自制而成，其結(jié)構(gòu)鑒定是通過與文獻(xiàn)中的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行比較得出，其純度由HPLC測定，均>95%，見圖1。

2方法與結(jié)果

21測定波長的選擇

取各亞精胺類化合物對照品，甲醇溶解，進(jìn)高效液相分析，DAD全波長掃描，根據(jù)各亞精胺類化合物的DAD全波長掃描的紫外圖譜選取各亞精胺類化合物的最大吸收波長作為含量測定時的檢測波長。最后得出亞精胺類化合物1的最大吸收波長為270 nm，亞精胺類化合物2的最大吸收波長為280 nm，亞精胺類化合物3的最大吸收波長為290 nm，亞精胺類化合物4的最大吸收波長為300 nm，所以進(jìn)行高效液相色譜分析時選取270，280，290，300 nm多波長同時檢測。

22液相色譜分析條件

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，分析柱為Agilent C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相為47%甲醇水等度洗脫，洗脫流速為10 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長為270，280，290，300 nm多波長檢測，進(jìn)樣體積為10 μL。

23對照品溶液的制備

混合對照品貯備液的配制：分別精密稱取亞精胺類化合物1（416 mg），亞精胺類化合物2（512 mg），亞精胺類化合物3（540 mg），亞精胺類化合物4（1004 mg），置于100 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到混合對照品溶液貯備液。

混合對照品溶液的配制：用吸量管精密吸取對照品貯備液05，08，20，30，40，50 mL分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成不同濃度的混合對照品溶液，按照22項下的液相色譜分析條件進(jìn)行高效液相色譜分析，混合對照品溶液的HPLC圖譜見圖2。

A混合對照品； B 新疆紅花； C 云南紅花； D 河南紅花。

圖2亞精胺類化合物混合對照品和樣品HPLC圖譜（λ=290 nm）

Fig2HPLC chromatograms of mixed standard and samples（λ=290 nm）

24供試品溶液的制備

精密稱取紅花藥材粉末（過60目篩）1000 0 g，置于100 mL 棕色的具塞錐形瓶中，精密加入15 mL 甲醇，稱重，超聲處理（超聲頻率40 kHz，功率比91%，超聲溫度25 ℃）10 min，放冷后再次稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻、過濾，取所得的紅花供試品溶液過045 μm微孔濾膜后按照22項下的高效液相色譜分析條件進(jìn)行高效液相色譜分析。

25方法學(xué)考察

251線性關(guān)系、定量限和檢測限精密量取上述混合對照品溶液適量，采用倍數(shù)稀釋法進(jìn)行稀釋，得到6個不同質(zhì)量濃度的系列對照溶液，按照上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，并記錄色譜峰面積，平行進(jìn)樣2次，以亞精胺類化合物的質(zhì)量濃度（g·L-1）為橫坐標(biāo)，以各亞精胺類化合物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制4個亞精胺類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表 1。結(jié)果4個亞精胺類待測組分的質(zhì)量濃度和峰面積的相關(guān)系數(shù)（r）均大于 0999 5，表明該方法的線性關(guān)系良好。

252精密度考察按照24項下方法制備紅花供試品溶液，吸取同一個供試品溶液按照22項下的液相色譜分析條件進(jìn)行高效液相色譜分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，通過計算各亞精胺類化合物的保留時間以及峰面積的RSD。結(jié)果顯示4個亞精胺化合物保留時間的RSD分別為064%，060%，054%，064%；4個亞精胺化合物峰面積的RSD分別為30%，47%，40%，26%，說明方法的精密度良好，儀器較為穩(wěn)定。

253穩(wěn)定性考察按照24項下方法制備供試品溶液，按照22項下的液相色譜分析條件分別于紅花供試品溶液制備后的0，2，4，6，12，24 h進(jìn)行高效液相色譜分析，通過計算各亞精胺類化合物的保留時間以及峰面積的RSD，進(jìn)行方法的穩(wěn)定性的考察。結(jié)果顯示4個亞精胺化合物保留時間的RSD分別為044%，060%，061%，047%；4個亞精胺化合物峰面積的RSD分別為33%，46%，42%，20%，結(jié)果表明紅花供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

254重復(fù)性考察取同一批紅花藥材粉末，按照24項下方法制備供試品溶液，重復(fù)制備6份，按照22項下的液相色譜分析條件進(jìn)行高效液相色譜分析，通過計算各亞精胺類化合物的保留時間以及峰面積的RSD，進(jìn)行方法的重復(fù)性的考察。結(jié)果顯示4個亞精胺化合物保留時間的RSD分別為031%，049%，064%，068%；4個亞精胺化合物峰面積的RSD分別為22%，46%，29%，21%，結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

255加樣回收率試驗精密稱取已知各亞精胺類化合物含量的紅花藥材粉末0500 0 g，平行9份，分別按照紅花樣品中各亞精胺類化合物含量的50%，100%，150%加入對照品溶液，每個濃度3份，按照24項下的方法制備供試品溶液，然后按照22項下的液相色譜分析條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積及各亞精胺類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算供試品溶液中4個亞精胺類化合物的含量，并計算各亞精胺類化合物的加樣回收率以及其RSD，結(jié)果顯示4個亞精胺化合物平均回收率分別為9861%，9968%，1009%，1001%；RSD分別為23%，25%，25%，30%，見表2。

26樣品測定

精密稱取紅花藥材（產(chǎn)自新疆、云南、河南）3份，按照24項下的方法制備供試品溶液，然后按照22項下的液相色譜分析條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，將4個亞精胺成分的峰面積代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，并計算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，見表3，色譜圖見圖2。實驗結(jié)果表明不同產(chǎn)地的紅花藥材中4個亞精胺成分的含量存在一定差異，其中新疆紅花中化合物4含量較高，將近是云南、河南產(chǎn)地的一倍，其他亞精胺差異成分不大。

3討論

本實驗根據(jù)4個亞精胺類化合物的DAD全波長掃描圖譜，確定各亞精胺類化合物的最大吸收波長分別為270，280，290，300 nm，所以進(jìn)行高效液相色譜分析時選取270，280，290，300 nm多波長同時檢測。在建立分離條件時考察了乙腈水，甲醇水等不同的洗脫系統(tǒng)，以及等度和梯度系統(tǒng)方式。由于4個亞精胺類化合物極性相近，在梯度系統(tǒng)下無法到達(dá)分離效果，最終篩選出的甲醇水（47∶63）作為洗脫液時樣品中的4個亞精胺類化合物有較好的分離，各個色譜峰的對稱性良好。

為了得到紅花中4個亞精胺類化合物較好的提取率，本實驗超聲提取及加熱回流提取效果，2種方式提取率相近，由于超聲提取相對方便快捷，因此選擇超聲提取法。此外，本實驗還對超聲時間以及提取次數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示各亞精胺類化合物的峰面積并不隨著超聲時間的延長以及提取次數(shù)的

表3不同產(chǎn)地紅花中亞精胺含量（n=3）

Table 3Contents of coumaroylspermidines in Carthamus tinctorius from different regions （n=3）mg·g-1

產(chǎn)地化合物1化合物2化合物3化合物4

新疆0165±00500330±00240405±00351140±0068

云南0142±00340320±00380403±00610644±0026

河南0196±00200427±00260530±00330680±0027

增加而增大，即超聲提取10 min，提取一次后紅花中的亞精胺類化合物已達(dá)到最大提取率，因此最終確定紅花供試品溶液的制備方法為超聲提取10 min，提取1次。

亞精胺類化合物的分離已有多篇文獻(xiàn)報道，且據(jù)文獻(xiàn)報道亞精胺類化合物表現(xiàn)出了廣泛的生物活性，但未有文獻(xiàn)對亞精胺類化合物的含量測定進(jìn)行研究，本實驗首次建立了紅花種亞精胺類化合物的高效液相色譜含量分析方法，該方法可同時測定了紅花4個亞精胺類化合物的含量，方法學(xué)考察結(jié)果顯示本文建立的4個亞精胺類化合物的高效液相色譜含量分析方法其精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及準(zhǔn)確度均良好，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，為以后亞精胺類化合物的含量測定研究提供了基礎(chǔ)。本文首次對產(chǎn)自新疆、云南、河南的紅花進(jìn)行了中亞精胺類化合物的含量測定，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的紅花藥材中4個亞精胺成分的含量存在一定差異，其中新疆紅花中化合物4含量較高，將近是云南、河南產(chǎn)地的1倍，其他亞精胺差異成分不大。

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[責(zé)任編輯丁廣治]