感冒靈提取過程近紅外光譜在線檢測技術研究

陳國權 潘紅燁 劉雪松 張躍飛 邵平 王龍虎

[摘要]中藥材提取過程是感冒靈顆粒劑生產(chǎn)過程的首個環(huán)節(jié)，對藥品質量影響顯著。該文在線采集感冒靈中藥材提取過程近紅外光譜圖，以高效液相色譜和差重法為參照方法，采用一階導數(shù)法處理近紅外光譜，運用偏最小二乘回歸法（PLSR）分別建立提取液中蒙花苷、綠原酸和固含量的定量校正模型。采用相關系數(shù)（r）、交叉驗證均方差（RMSECV）、校正集均方差（RMSEC）和驗證集均方差（RMSEP）等指標優(yōu)化建模參數(shù)，考察模型性能。3種質量控制指標的模型相關系數(shù)均達到095以上，蒙花苷和綠原酸、固含量的RMSEC和RMSEP分別為0010 4和0009 47，0009 34和0142，0055 5和0008 42，在線分析所建模型，預測值與實際測定值相關系數(shù)均大于097，其預測相對偏差（RSEP）分別為814%，817%，986%。研究結果表明，利用近紅外光譜技術可以實現(xiàn)感冒靈中藥提取過程多指標的在線檢測和實時監(jiān)控，該技術可用于生產(chǎn)過程中質量控制，縮小中間體批次差異性，保證藥品質量穩(wěn)定性，也為后續(xù)的產(chǎn)品質量回溯提供了實時生產(chǎn)數(shù)據(jù)。

[關鍵詞]近紅外光譜；提取過程；在線監(jiān)測；感冒靈

[Abstract] Extraction of the four Chinese herbals is the beginning step of the production process of coldrine granules and influences on drug quality significantly In this paper， the online near infrared spectrum was collected during the extraction process of coldrine and then preprocessed by the first derivative Partial least square regression （PLSR） model was developed for the quantity indicators of linarin， chlorogenic acid and solid content， according to results of both HPLC and weightloss as reference methods The correlation coefficient， root mean square error of crossvalidation （RMSECV）， root mean square error of calibration （RMSEC） and root mean square error of prediction （RMSEP） were used to optimize model parameters and confirm their performance Correlation coefficients of three quality control indicator models reached more than 095Values of RMSEC of linarin， chloroenic acid and solid content were 0010 4， 0009 34 and 0055 5， respectively And the values of RMSEP were 0009 47， 0142 and 0008 42， respectively The models， built online analyze data， revealed that the correlation coefficients of predicted values and measured values were greater than 097 and values of RSEP of linarin， chloroenic acid and solid content were 814%， 817% and 986%， respectively The results showed that the NIR method could achieve the online detection and realtime monitoring of multiindexes during the extraction process of coldrine The technology could be used for drug quality control in the process of practical production， reducing the batch differences and ensuring pharmaceutical quality stability In addition， it could provide realtime production data for subsequent product quality backtracking

[Key words]nearinfrared spectroscopy； extraction process； online monitoring； coldrine granules

doi：10.4268/cjcmm20160804

近紅外光譜技術（nearinfrared spectroscopy）因其無污染、樣品無需前處理和快速檢測等優(yōu)點[13]，已經(jīng)廣泛應用于中藥原藥材質量快速評價[45]、生產(chǎn)過程在線質量控制及成品的有效成分含量快速測定等方面[6]。感冒靈顆粒[7]是由三叉苦、野菊花、崗梅、金盞銀盤等4味中藥與對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、咖啡因等化藥組成的，中西結合治療感冒的藥品。在感冒靈顆粒生產(chǎn)過程，中藥材的提取[8]是其首個環(huán)節(jié)，而且提取工藝會直接影響藥品的質量與療效。在感冒靈大品種技術升級項目實施過程中，為了提高中藥生產(chǎn)工藝并建立有效的過程控制方法，本文研究了感冒靈中藥提取過程實時監(jiān)控技術，即采用近紅外光譜技術建立感冒靈提取液中固含量、蒙花苷和綠原酸含量的在線檢測模型，實現(xiàn)了中藥提取裝置內(nèi)溶液3個指標成分含量變化的實時監(jiān)控。感冒靈提取過程近紅外光譜在線檢測技術的應用，不僅有利于對感冒靈提取過程的質量控制，也為藥品質量回溯提供了大量的基礎數(shù)據(jù)。

1材料

1 000 L多功能中藥提取設備（浙江溫兄機械閥門有限公司）；Bruker MATRIXF近紅外光譜儀（德國布魯克），配有透射檢測器和采樣系統(tǒng)；Waters alliance E2695高效液相色譜儀（Waters，USA）；H1650W高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；SG5200 HPT超聲波清洗機（上海冠特超聲儀器有限公司）。

野菊花、三叉苦、金盞銀盤和崗梅藥材均由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供，并由浙江大學藥學院徐娟華副教授鑒定，分別為菊科植物野菊的干燥頭狀花序、蕓香科植物三叉苦的干燥莖和枝、菊科植物金盞銀盤的干燥全草、冬青科植物梅葉冬青的干燥根及莖。

乙腈（色譜純，默克公司）；甲酸（分析純，阿拉丁公司）。蒙花苷對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，MUST15101207）、綠原酸對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，MUST15041814），純度995%。

2方法

21提取工藝與近紅外光譜采集

生產(chǎn)過程在線監(jiān)測系統(tǒng)見圖1。每次取100 kg中藥材（三叉苦273 kg、野菊花137 kg、金盞銀盤182 kg、崗梅409 kg）于提取罐中，加水煎煮提取2次，每次2 h。整個提取過程實現(xiàn)升溫、保溫、煎煮、出藥和除渣的全自動控制。

為提高測量精度和準確性，本研究建立了新的近紅外在線檢測系統(tǒng)，并采用靜態(tài)光譜采集方法。采集光譜前，關閉閥門1～3；光譜采集完成后，打開閥門3，開始取樣；取樣結束后，關閉閥門3，同時開啟閥門1和2，使新鮮藥液持續(xù)經(jīng)過流通池。采集參數(shù)如下：光譜采集時間間隔10 min，以空氣為參比，掃描次數(shù)32次，分辨率8 cm-1，掃描范圍4 000～12 000 cm-1。光譜數(shù)據(jù)的采集、傳輸和處理通過OPUS軟件完成。

22固含量測定

感冒靈提取過程的固含量測定采用差重法，取烘干至恒重（連續(xù)2次稱重差異小于5 mg）的扁形瓶（X0），取約5 mL提取液，精密稱定（X1），置干燥箱中105 ℃烘5 h，取出置干燥器中冷卻30 min，稱重，再置干燥箱中烘1 h，精密稱重（X2），質量差異5 mg以上者繼續(xù)置干燥箱中烘，直至差異小于5 mg。根據(jù)減失質量，計算供試品中固含量（%）。

固含量=（X2-X0）/（X1-X0）×100%

23綠原酸與蒙花苷含量測定

231 色譜條件色譜柱Waters X Bridge Shield RP18（46 mm×250 mm，5 μm），進樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速10 mL·min-1，檢測波長334 nm，流動相05%甲酸（A）乙腈（B），洗脫梯度（0～7 min，13%B；7～27 min，13%～30%B；27～35 min，35%～40%B；后運行15 min）。

232 供試品制備取適量提取液樣品溶液于15 mL離心管中，在轉速13 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，即得。

233 對照品制備精密稱取2 mg蒙花苷對照品置于20 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，備用。精確稱取2 mg綠原酸對照品于20 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，備用。

234線性、精密度和重復性考察取蒙花苷儲備液，按梯度進行稀釋，配成9個不同濃度的工作液，進樣分析。以色譜峰面積（Y）對進樣濃度（X）進行線性回歸。線性范圍為0～1202 g·L-1，r=0999 5。

取綠原酸儲備液，按梯度進行稀釋，配成9個不同濃度的工作液，進樣分析。以色譜峰面積（Y）對進樣濃度（X）進行線性回歸。線性范圍為0～0324 1 g·L-1，r =0999 9。

取批號為15121201的提取終點樣品，按232方法處理后，按231液相條件連續(xù)進樣6次，綠原酸和蒙花苷的峰面積RSD分別為052%，050%，表明儀器精密度良好。

取相同提取液，按照232方法制備6份樣品溶液，以231色譜條件，測得6份樣品中綠原酸和蒙花苷的峰面積RSD分別為029%，035%，表明該方法重復性良好。

235穩(wěn)定性考察取批號為15121201的提取終點樣品，按照232方法制備樣品溶液，以231色譜條件，分別于0，4，8，12，16，20，24，28，32，36 h進樣分析。綠原酸和蒙花苷峰面積的RSD分別為067%，041%，結果表明樣品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

236 加樣回收率考察取已知含量的批號為15121201的提取終點樣品，分別設置樣品含量的80%，100%，120%為低、中、高濃度，每個濃度3個樣品，共9個樣品，精密量取。分別精密加入相應的低、中、高濃度的對照品，每份均按232項下方法處理后，按231液相條件進樣，分別計算綠原酸與蒙花苷的含量。結果顯示綠原酸的回收率在99%～100%，RSD 039%，蒙花苷回收率在98%～100%，RSD 073%，表明方法準確可靠，符合定量測定要求。

24數(shù)據(jù)處理與模型性能評價

運用Bruker公司的OPUS軟件的偏最小二乘法（PLSR）建立感冒靈提取過程中提取液的固含量、蒙花苷和綠原酸含量的近紅外定量分析模型。模型建立前對校正集光譜進行異常點判別，以提高模型精度，同時原始光譜在平滑、微分等適宜的光譜預處理方法下來消除儀器背景或漂移對信號的影響，選擇合適的波段提取有效信息，減少計算量，減小模型復雜程度。本文采用校正集相關系數(shù)（rc）、交叉驗證均方差（RMSECV）、校正集均方差（RMSEC）和驗證集均方差（RMSEP）等指標優(yōu)化建模參數(shù)，考察模型性能。模型對未知樣品的預測效果采用預測均方差（RMSEP）、相對偏差（RSEP）和驗證集相關系數(shù)（rv）來考核。一般來說，模型相關系數(shù)越接近于1，RMSEC和RMSEP越小且越接近，分析效果越好，RSEP越小說明模型的預測效果越好。

3結果與討論

31光譜預處理及波段選擇

PLSR可以處理全譜信息，但因包含過多冗余信息，會影響建模效率和增加模型復雜程度，故建模前光譜區(qū)間篩選至關重要，以改善模型性能，提高計算速度[9]。感冒靈中藥材采取水提法，由于水中的羥基有很強的極性，要特別注意其在近紅外譜區(qū)的6 944，5 155 cm-1附近以合頻與倍頻吸收譜帶形成的兩大“水峰”[1011]，在進行近紅外吸收光譜分析時，應盡可能減少其干擾。此外，9 750～12 000 cm-1光譜信息較少，沒有顯著的特征吸收，為減少計算機運算量，提高建模效率，也不宜建模。在近紅外透射光譜的采集過程中，外界環(huán)境的變化會引起光譜基線的偏移，隨機噪聲和樣品背景干擾也會影響校正結果[12]。因此，在對近紅外光譜進行分析之前，一般要對光譜數(shù)據(jù)進行預處理，以提高模型的預測準確性。

本研究通過OPUS軟件對比研究了各種預處理方法和不同建模波段對提取液的固含量、綠原酸和蒙花苷含量模型的影響，結果見表1。通過比較發(fā)現(xiàn)，固含量模型的最佳波段為5 3923～9 4037 cm-1，綠原酸模型的最佳波段為5 4232～54 534 cm-1， 6 2948～6 5031 cm-1，蒙花苷模型的最佳波段為5 39227～5 45398， 6 0943～6 5031 cm-1，采用一階導數(shù)法對光譜進行預處理后能有效消除基線偏移，減少峰與峰之間的重疊并使有效信息顯現(xiàn)出來，r較大，且RMSECV較小。

32定量模型的建立

應用OPUS軟件自動優(yōu)化功能，經(jīng)過異常點判斷、光譜預處理和建模波段的選擇后，最終得到213個樣品用于建模，隨機選取183個樣品作為校正集。用偏最小二乘法建立感冒靈提取過程固含量、綠原酸和蒙花苷含量的近紅外定量校正模型，分別獲得提取過程固含量模型、綠原酸模型和蒙花苷模型的校正集實測值和NIR預測值的相關性圖，見圖2。蒙花苷、綠原酸和固含量定量模型校正集相關系數(shù)分別為0956 5，0965 3，0995 2，RMSEC分別為0010 4，0009 34，0055 5，說明模型性能良好。

33各質量控制指標在線分析

將預先建立的模型導入系統(tǒng)工作站，在線采集近紅外光譜，所得近紅外光譜自動導入所建模型中，同步預測感冒靈提取過程中固含量、蒙花苷和綠原酸含量信息，并在工作站中實時顯示各質量控制指標含量的變化趨勢。為進一步驗證在線檢測結果的準確性，本文將近紅外檢測數(shù)據(jù)（預測值）與傳統(tǒng)方法檢測結果（實測值）進行比較，見圖3。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析表明，提取液的固含量、綠原酸和蒙花苷的RMSEC和RMSEP分別為0055 5和0008 42，0009 34和0142，0010 4和0009 47，其預測相對偏差（RSEP）分別為986%，817%，814%，可滿足生產(chǎn)過程實時分析的精度要求。在提取過程中濃度變化趨勢上，在線檢測結果和傳統(tǒng)方法是一致。所以，近紅外在線方法基本與提取工藝的結果是吻合的。

不同的指標，預測精度有所差異。相對地，固含量定量模型要優(yōu)于綠原酸和蒙花苷定量模型，其原因在于其含量較大且該指標測定的是提取液中所含固體物質，受水峰影響較小。一煎過程中25～80 min綠原酸含量的預測值要低于實測值，二煎初期各指標預測值較實測值略高。其原因是由于該批次的提取過程初期工況尚不穩(wěn)定。此外，提取液靜置時液體中顆粒物沉降不完全、提取溫度變化等因素也會影響近紅外光譜的采集。

4結論

近年來，關于近紅外在線分析方法的研究和應用日益受到重視，但是真正意義上在生產(chǎn)設備上實施該技術的并不多見。在感冒靈工業(yè)生產(chǎn)的提取裝置上，本文建立了近紅外在線檢測系統(tǒng)，研究了蒙花苷、綠原酸和固含量等指標成分的分析方法，并用傳統(tǒng)分析方法對這些檢測結果進行檢驗，客觀地評價近紅外在線分析方法的誤差范圍。生產(chǎn)過程的應用實踐表明，本文所建立的模型預測精度高，準確度高，滿足中藥制劑實際生產(chǎn)中定量分析的要求。該法與傳統(tǒng)藥典方法相比，在保證準確度的基礎上，大大提高了分析效率，為實時監(jiān)控中藥生產(chǎn)過程關鍵質量指標變化提供了可行方法，同時為后續(xù)的產(chǎn)品質量回溯提供了大量的實時生產(chǎn)數(shù)據(jù)。

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[責任編輯孔晶晶]