水稻BRI1啟動子克隆與表達載體構(gòu)建

田翠霞 魏強 李憲彬

摘要：為探究擬南芥和水稻BRI1基因差異表達的原因，本研究克隆了OsBRI1啟動子，并將其構(gòu)建在植物表達載體pCambia2300-GUS上，為進一步轉(zhuǎn)化擬南芥或其他植物并研究其表達模式奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；油菜素內(nèi)酯；OsBRI1

中圖分類號：S511+Q78文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）08-0001-05

AbstractIn order to explore the reasons for expression difference of BRI1 in rice and Arabidopsis thaliana， we cloned the OsBRI1 promoter and connected it on the plant expression vector pCambia2300-GUS. These results laid foundations for further transformation into Arabidopsis or other plants and study on its expression patterns.

KeywordsRice； Brassinosteroids； OsBRI1

植物激素（plant hormone）是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一類在很低濃度時即可對植物的生長發(fā)育、代謝、環(huán)境應(yīng)答等生理過程產(chǎn)生重要調(diào)控作用的代謝產(chǎn)物，在植物生長過程中扮演著極其重要的角色。植物中最早發(fā)現(xiàn)的一類甾醇類激素是蕓苔甾內(nèi)酯（brassinolide， BL）[1]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)60多種具BL結(jié)構(gòu)的類似物，廣泛存在于植物的不同組織和器官中，由于它們的功能與BL相似，統(tǒng)稱為油菜素甾醇類物質(zhì)（brassinosteroid， BR）[2-4]，BL是油菜素甾醇類成員中生物活性最強的一種分子。隨著BR結(jié)構(gòu)鑒定和人工合成BR的出現(xiàn)，科學(xué)家們進行了大量的生理學(xué)研究，不僅確定了BR在多種植物中的促生長作用，還揭示了BR的多種其它功能，包括種子萌發(fā)、氣孔形成、維管分化、株型、開花、雄性可育性和抑制衰老等[5]。外施具生物活性的BR能增強植物對各種脅迫的抗性，包括生物和非生物脅迫[6-8]。自20世紀(jì)80年代起，BR已被廣泛用于增加農(nóng)作物和蔬菜的產(chǎn)量。在水稻中，BR影響許多農(nóng)藝性狀如糧食產(chǎn)量、株高、葉角、籽粒大小和分蘗數(shù)等[9，10]。

BR的感知和信號傳遞過程需要眾多基因參與，首先通過一個定位于細胞膜上的富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeats， LRRs）的跨膜類受體蛋白激酶BRI1 （brassinosteroid insensitive 1） 感知傳遞信號[11，12]，然后才能激活一系列的信號級聯(lián)傳遞[13，14]。利用AtBRI1啟動子在野生型擬南芥中驅(qū)動GUS表達，顯示AtBRI1在根、莖、葉柄及葉中廣泛表達[15]。采用RT-PCR技術(shù)，檢測水稻各組織器官中OsBRI1的表達模式，其主要在芽中表達，在根部表達不明顯[16]。本文構(gòu)建了OsBRI1啟動子（pOsBRI1）的表達載體，為利用pOsBRI1在野生型擬南芥中驅(qū)動GUS報告基因的表達，在同一水平觀察水稻和擬南芥BRI1的表達位置及表達量的差異，以及揭示OsBRI1基因的表達特征奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗材料水稻日本晴基因組DNA。

1.1.2菌株和載體大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pCambia2300-GUS載體質(zhì)粒由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進化發(fā)育實驗室保存?？寺≥d體pMD19-Simple購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3酶、試劑盒及其他耗材LA Taq酶、Sal Ⅰ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase、6×DNA Loading Buffer、DNA Marker、dNTP Mixture 購自寶生物工程（大連）有限公司；KOD FX（附有dNTPs，KOD Buffer） 購自KOD公司；NheⅠ、RNA溶解酶溶液購于NEB公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit購自O(shè)miga；其他藥品試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.4引物和測序PCR引物合成及DNA測序工作由南京金斯瑞生物工程股份有限公司完成。

1.2試驗方法

1.2.1引物設(shè)計根據(jù)TAIR （The Arabidopsis Information Resource）網(wǎng)站上AtBRI1的基因序列，在網(wǎng)站Phytozm中查找水稻日本晴BRI1基因，定義起始密碼子ATG上游2 000 bp為啟動子序列。根據(jù)表達載體pCambia2300-GUS插入位點的酶切位點設(shè)計PCR引物，pOsBRI1-F： 5′-GCGTCGACCCCAATGCATGGATAGTTTAGGTTG3′ （下劃線為限制性內(nèi)切酶SalⅠ的酶切位點），pOsBRI1-R： 5′-CGGGATCCGAAGTGATGAGGAGGAGATGGAGAGAG-3′ （下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的酶切位點）。

1.2.2啟動子克隆以水稻日本晴基因組DNA為模板，用設(shè)計的引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，10 pmol/μL上下游引物各1.5 μL，Template DNA 1 μL，1.0 U/μL KOD FX 1 μL，最后加ddH2O將反應(yīng)體系調(diào)至50 μL。PCR反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性5 min；98℃變性15 s， 58℃退火30 s， 68℃延伸2 min 20 s，循環(huán)25次；68℃延伸10 min，16℃恒溫保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像系統(tǒng)檢測并記錄結(jié)果。將PCR回收產(chǎn)物加A，純化，與載體pMD19-Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆抽提質(zhì)粒進行酶切檢測，將檢測的陽性質(zhì)粒送去測序。

1.2.3表達載體構(gòu)建將測序正確的質(zhì)粒及pCambia2300-GUS載體質(zhì)粒進行SalⅠ、BamHⅠ雙酶切。酶切體系為：pOsBRI1質(zhì)粒5 μL，SalⅠ、BamHⅠ各0.5 μL，1.5×T Buffer 2 μL加ddH2O平衡反應(yīng)體系終體積到20 μL；同時在另一小EP管中加入pCambia2300-GUS載體質(zhì)粒5 μL，SalⅠ、BamHⅠ各0.5 μL，1.5×T Buffer 2 μL加ddH2O平衡反應(yīng)體系終體積到20 μL。將以上兩個酶切體系同時置于37℃保溫箱中反應(yīng)3 h。酶切結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳純化反應(yīng)產(chǎn)物，并回收目的片段及載體片段。用T4連接酶將目的片段連接到pCambia2300-GUS載體上。連接體系10 μL：pCambia2300-GUS載體1.5 μL、目的片段7 μL、T4 DNA連接酶0.5 μL、10×T4 DNA ligase Buffer 1 μL，16℃反應(yīng)12 h。載體構(gòu)建示意圖見圖1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑選陽性抗性菌落進行PCR檢測，將陽性菌落擴大培養(yǎng)，提質(zhì)粒，進行雙酶切再檢測。

2結(jié)果與分析

2.1OsBRI1啟動子的克隆

以水稻日本晴基因組DNA為模板，用pOsBRI1-F和pOsBRI1-R為引物，進行PCR擴增。電泳檢測結(jié)果（圖2）顯示，擴增出2 000 bp左右的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符。

將回收的PCR產(chǎn)物加尾純化后連接到pMD19-Simple 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選白色單菌落，使用菌落PCR方法進行初步篩選，將菌落PCR檢測得到的陽性菌抽提質(zhì)粒，進行雙酶切（SalⅠ和BamHⅠ、NheⅠ和BamHⅠ）及單酶切（NheⅠ）檢測，由圖3可知，酶切片段與預(yù)期相符，說明目的片段已連接到載體上。將檢測陽性的質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與Phytozm網(wǎng)站提供的水稻日本晴序列對比結(jié)果見圖4，說明基因未發(fā)生突變。

2.2表達載體構(gòu)建

將OsBRI1啟動子經(jīng)酶切連接到pCambiaM：DNA Marker；1：SalⅠ與BamHⅠ雙酶切片段；2：NheⅠ單酶切片段；3：NheⅠ和BamHⅠ雙酶切片段；SalⅠ與BamHⅠ雙酶切片段分別長2 065、2 692 bp；NheⅠ單酶切片段長4 757 bp；NheⅠ和BamHⅠ雙酶切片段分別長1 224、3 533 bp。

2300-GUS表達載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對陽性菌抽提質(zhì)粒進行雙酶切（SalⅠ和BamHⅠ）鑒定（圖5），結(jié)果顯示pOsBRI1成功連接到pCambia2300-GUS表達載體上。

3討論與結(jié)論

BR是一種廣泛存在于植物中的類固醇激素，通過位于細胞膜上的跨膜類受體蛋白激酶BRI1感知和傳遞信號。已有的研究表明，擬南芥BRI1在整個植株內(nèi)廣泛表達，但水稻BRI1在根部表達不明顯。BRI1在水稻和擬南芥中的表達差異是基因本身造成的還是由于啟動子區(qū)的差異所致，為了探究其原因，我們對十字花科和禾本科BRI1基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)BRI1的編碼序列保守，但其啟動子區(qū)存在多樣性，由此推測，啟動子區(qū)的多態(tài)性可能導(dǎo)致BRI1蛋白在水稻和擬南芥中的表達差異。因此，我們根據(jù)已經(jīng)公布的水稻日本晴基因序列，結(jié)合表達載體pCambia2300-GUS上的酶切位點，設(shè)計引物克隆得到OsBRI1啟動子，并成功連接到pCambia2300-GUS載體上。該研究為進一步研究十字花科與禾本科BRI1表達差異奠定了基礎(chǔ)，以期為深入探究水稻的BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制做出貢獻。

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