結(jié)腸癌與結(jié)腸腺瘤患者常見腸道菌群數(shù)量比較

孟憲紅,劉鐵夫,劉平,許鵬,劉勇(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院,哈爾濱 150001)

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結(jié)腸癌與結(jié)腸腺瘤患者常見腸道菌群數(shù)量比較

孟憲紅,劉鐵夫,劉平,許鵬,劉勇(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院,哈爾濱 150001)

摘要：目的通過比較結(jié)腸癌與結(jié)腸腺瘤的常見腸道菌群數(shù)量，為結(jié)腸癌的防治提供新思路。方法30例結(jié)腸鏡鏡檢取材、病理明確為結(jié)腸癌手術(shù)前未做腸道準(zhǔn)備患者，30例結(jié)腸鏡檢查體檢發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腺瘤患者，30例正常人群，晨起排便。用稀釋平板計(jì)數(shù)法和快速細(xì)菌鑒定方法取材、定量、稀釋，于37 ℃分別進(jìn)行厭氧、需氧培養(yǎng)，每株細(xì)菌由平板活菌菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。比較結(jié)腸癌與結(jié)腸腺瘤的腸道菌群數(shù)量。結(jié)果結(jié)腸癌患者大腸桿菌和糞腸球菌數(shù)量明顯高于正常人群;而雙歧桿菌、乳桿菌及類桿菌數(shù)量相比正常人群明顯減少(P均<0.05)。在正常人群、結(jié)腸管狀腺瘤患者和結(jié)腸癌患者腸道內(nèi)，大腸桿菌和糞腸球菌的數(shù)量依次增加(P<0.05)，而厭氧菌雙歧桿菌、乳酸桿菌和類桿菌等數(shù)量則逐漸減少(P<0.05)。結(jié)論 結(jié)腸癌患者腸道菌群失調(diào)比結(jié)腸腺瘤患者嚴(yán)重，內(nèi)環(huán)境紊亂;結(jié)腸癌的防治可從調(diào)節(jié)腸道菌群入手。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌；結(jié)腸腺瘤；腸道菌群；菌落計(jì)數(shù)法

據(jù)報(bào)道，大腸癌的發(fā)病率和病死率居世界癌癥中的前三位[1]。無論是流行病學(xué)調(diào)查，抑或分子及細(xì)胞生物學(xué)研究均表明，飲食因素在結(jié)腸癌的發(fā)生中至關(guān)重要[2]。而飲食因素發(fā)揮影響則相當(dāng)大程度上依賴人體腸道細(xì)菌的代謝活動(dòng)。腸道微生物參與人體的能量獲取和儲(chǔ)存，以及在各種代謝如發(fā)酵和吸收未消化碳水合物中發(fā)揮功能。腸道微生物群與免疫系統(tǒng)相互作用，提供信號(hào)促進(jìn)正常免疫細(xì)胞的成熟和免疫功能的發(fā)展[3]。2015年1～12月，筆者通過對(duì)比正常人群與結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌患者術(shù)前腸道菌群的常見腸道細(xì)菌，選取2種有代表性的需氧、兼氧性細(xì)菌-大腸桿菌、糞腸球菌及3種有代表性的厭氧性細(xì)菌-彎曲桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌進(jìn)行定性、定量分析，探究結(jié)腸癌與結(jié)腸腺瘤腸道菌群的不同點(diǎn)，為結(jié)腸癌的防治提供新思路。

1資料與方法

1.1臨床資料行結(jié)腸鏡鏡檢取材、病理檢查證實(shí)結(jié)腸癌患者30 例(結(jié)腸癌組)，其中男16例、女14例，年齡52～72歲，平均62歲；結(jié)腸鏡檢查示結(jié)腸管狀腺瘤患者30例(腺瘤組)，其中男15例、女15例，年齡50～72歲，平均60歲；正常人群30例作為正常組，其中男15例，女15例，年齡50～72歲，平均62歲，無腹瀉、肝膽胰疾病等消化道疾病史，無吸毒史。所選病例為正常人群、體檢發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌確診患者且手術(shù)前未做胃腸道準(zhǔn)備，晨起排便，患者采樣前1個(gè)月均未使用抗生素和微生態(tài)活菌制劑和聚乙二醇等瀉藥。

1.2細(xì)菌計(jì)數(shù)方法取適量新鮮糞便，30 min內(nèi)送檢。稱取0.1 g的糞便于EP 管中，加入0.9 mL 生理鹽水，系列倍比稀釋，各稀釋度取0.05 mL用接種環(huán)分別接種至選擇性培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行初次分離培養(yǎng)。需氧菌(37 ℃)、厭氧菌(37.5 ℃)分別培養(yǎng)18～24 h及24～48 h(厭氧培養(yǎng))，如無菌生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)至1 周。然后對(duì)厭氧菌挑取少許菌落做二次傳代厭氧培養(yǎng)。最后用平板計(jì)數(shù)法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。每克標(biāo)本中活菌集落單位計(jì)算公式： 活菌集落單位=(標(biāo)本質(zhì)量+稀釋量)/標(biāo)本質(zhì)量×稀釋度×菌落個(gè)數(shù)×(稀釋度及稀釋倍數(shù))計(jì)數(shù)。

1.3細(xì)菌鑒定方法接種前，涂片觀察菌株的純度、革蘭染色反應(yīng)和菌落形態(tài)，然后將菌株接種入3 mL 接種液(經(jīng)高壓消毒的去離子水)，制成至少相當(dāng)于Mc-Farland 3 標(biāo)準(zhǔn)液但不高于McFarland 5 標(biāo)準(zhǔn)液的渾濁懸濁液。然后，在每一個(gè)含有基底的每一個(gè)孔和2個(gè)控制孔中加入50 μL細(xì)菌懸浮液。然后將已接種的鑒定板在MicroScan WalkAway- 40鑒定與藥敏測(cè)試系統(tǒng)中，35～37 ℃的條件下孵育4 h。記錄鑒定板上所有底物的結(jié)果，并與相應(yīng)細(xì)菌數(shù)據(jù)庫比較。

2結(jié)果

與正常組相比,結(jié)腸癌組大腸桿菌、糞腸球菌明顯增多，雙歧桿菌、乳桿菌和類桿菌則明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。彎曲桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌等厭氧菌數(shù)量在正常組、腺瘤組、結(jié)腸癌組中依次逐漸遞減，大腸桿菌、糞腸球菌數(shù)量依次遞增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　三組腸道菌群數(shù)量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與結(jié)腸癌組比較，△P<0.05。

3討論

隨著社會(huì)進(jìn)步及人們飲食結(jié)構(gòu)變化，結(jié)腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)城市化、年輕化趨勢(shì)，現(xiàn)已成為我國最常見的消化道惡性腫瘤之一。結(jié)腸腺瘤是一種結(jié)腸的良性腫瘤，被公認(rèn)為癌前病變，系常見病、多發(fā)病[4]。現(xiàn)有理論研究認(rèn)為，大腸腺瘤在大腸癌形成發(fā)展過程中不可避免，積極治療大腸腺瘤是預(yù)防大腸癌的重要途徑。研究表明大腸癌的發(fā)生是多因素、多階段、多環(huán)節(jié)過程，其中較明確和重要的環(huán)節(jié)是基因突變，尤其腫瘤抑制基因如APC和p53的失活、致癌基因如Ras家族的激活等[5]。另外，腸道菌群作為腸道環(huán)境的重要組成部分，在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中亦有一定作用[6]。腸道菌群在人類健康和疾病中發(fā)揮重要作用。在人類消化道內(nèi)包含數(shù)目驚人的活細(xì)菌，細(xì)菌細(xì)胞達(dá)100 萬億個(gè)，其數(shù)目是人體細(xì)胞總量的10 倍以上，種類亦有100 種以上[7]。腸道內(nèi)細(xì)菌與細(xì)菌間相互依存、相互制約，是人體正常生理機(jī)能的關(guān)鍵[8]。在胃和十二指腸的含量為每克101～103個(gè)微生物，人體腸道菌群空腸和回腸的微生物密度達(dá)到每克104～107個(gè)，在結(jié)腸和糞便中含量則高達(dá)每克1013～1014個(gè)[9]。

正常生理?xiàng)l件下，腸道菌群相互作用相互依存，保持一定的數(shù)量和比例，身體處于相對(duì)平衡狀態(tài)，而某一原籍菌或外來菌的水平增高,是促進(jìn)細(xì)菌移位的重要原因。人體抵抗力降低情況下,如腹瀉、營養(yǎng)不良及免疫力低下、長(zhǎng)期大量使用廣譜抗生素等,常伴隨腸道菌群改變。隨之,腸道微生態(tài)的改變成為消化吸收障礙、細(xì)菌移位及感染的病理生理基礎(chǔ)。正常腸道菌群可激活免疫系統(tǒng)，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，通過分泌諸多的細(xì)胞因子，防止疾病發(fā)生和發(fā)展[10～12]。

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是腸道正常菌群間相互依存、制約形成的微環(huán)境,對(duì)于腸道形態(tài)、功能的維持起重要作用，是人體最主要、最復(fù)雜的微生物系統(tǒng)[13]。腸道內(nèi)細(xì)菌占人體微生物總數(shù)的78%，其最顯著的特征是穩(wěn)定性。腸道細(xì)菌與人體的能量、物質(zhì)代謝關(guān)系密切,維持人體健康。

目前,國內(nèi)外研究主要集中于飲食結(jié)構(gòu)、腸道菌群分類在結(jié)直腸癌中的作用,對(duì)結(jié)腸息肉等癌前病變患者腸道菌群的研究較少。本研究表明隨著發(fā)生癌前病變——結(jié)腸腺瘤，人體腸道菌群的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，而結(jié)直腸癌患者體內(nèi)腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象則更加普遍。因此,對(duì)結(jié)直腸癌及結(jié)腸息肉患者進(jìn)行腸道微生態(tài)的研究有較強(qiáng)實(shí)用價(jià)值。疾病狀態(tài)往往與相關(guān)的腸道菌群失衡有關(guān)。在國外通過移植腸道微生物恢復(fù)一個(gè)健康的微生物群落已被證明在某些疾病治療中有價(jià)值。目前，關(guān)于結(jié)腸癌患者腸道菌群與正常人分布的不同已被證實(shí)，但未見報(bào)道結(jié)腸息肉及結(jié)腸癌患者腸道菌群的變化比較，本研究結(jié)果顯示，與正常組相比,結(jié)腸癌組大腸桿菌、糞腸球菌明顯增多，雙歧桿菌、乳桿菌和類桿菌則明顯減少,彎曲桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌等厭氧菌數(shù)量在正常組、腺瘤組、結(jié)腸癌組中依次逐漸遞減，大腸桿菌、糞腸球菌數(shù)量依次遞增。說明結(jié)腸癌患者腸道菌群失調(diào)嚴(yán)重，內(nèi)環(huán)境紊亂；結(jié)腸癌防治可從調(diào)節(jié)腸道菌群入手。

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(收稿日期：2015-11-01)

中圖分類號(hào)：R735.35

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)13-0052-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.020

通信作者：劉勇(E-mail:1643339811@qq.com)

基金項(xiàng)目：黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(2014-373)。