結(jié)直腸癌圍手術(shù)期患者外周血T淋巴細胞CD69、HLA-DR表達變化及意義

王祥安，吳瓊，虞黎明，鄒鎮(zhèn)洪，蔡磊，熊妮，楊剛(南昌大學第二附屬醫(yī)院，南昌330006；南昌大學)

?

結(jié)直腸癌圍手術(shù)期患者外周血T淋巴細胞CD69、HLA-DR表達變化及意義

王祥安1，吳瓊1，虞黎明1，鄒鎮(zhèn)洪1，蔡磊1，熊妮2，楊剛1(1南昌大學第二附屬醫(yī)院，南昌330006；2南昌大學)

摘要：目的觀察結(jié)直腸癌患者圍手術(shù)期外周血T淋巴細胞CD69、HLA-DR的表達變化，并探討其臨床意義。方法 采用流式細胞儀檢測40例結(jié)直腸癌患者(觀察組)術(shù)前、術(shù)后第5、10天外周血T淋巴細胞CD69、HLA-DR的表達，并與同期檢測15例健康體檢者(對照組)進行比較，分析CD69、HLA-DR表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果觀察組術(shù)前CD69、HLA-DR表達明顯低于對照組(P<0.05)，術(shù)后CD69、HLA-DR表達水平均較術(shù)前明顯提高(P<0.05)。HLA-DR表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05),與其余臨床病理參數(shù)無關(guān)(P均﹥0.05)。 結(jié)論 結(jié)直腸癌患者術(shù)前外周血T淋巴細胞CD69、HLA-DR表達明顯降低，術(shù)后逐漸升高；檢測二者表達有助于病情判斷，進一步指導結(jié)直腸癌免疫治療。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸腫瘤;圍手術(shù)期;T淋巴細胞;CD69;HLA-DR

我國結(jié)直腸癌發(fā)病率不斷上升，據(jù)統(tǒng)計現(xiàn)已躍居惡性腫瘤第二位[1]。結(jié)直腸癌早期篩查率與診斷率低，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于進展期。T淋巴細胞參與任何免疫反應均必須首先被活化[2]，CD69、HLA-DR為T淋巴細胞活化分子標志物。2015年3～7月，我們對40例結(jié)直腸癌患者外周血T淋巴細胞CD69、HLA-DR表達進行檢測，探討其臨床意義。

1資料與方法

1.1臨床資料結(jié)直腸癌患者40例(觀察組)，男21例、女19例，年齡(58.0±11.1)歲。納入標準：①術(shù)前內(nèi)鏡活檢病理確診為結(jié)直腸癌；②術(shù)前未接受放、化療及其他抗腫瘤治療措施。排除標準：①病程合并自身免疫疾病或接受過骨髓移植；②使用免疫抑制劑；③合并其他惡性腫瘤及腫瘤手術(shù)史；④急、慢性感染者。腫瘤位于結(jié)腸17例，直腸23例；腫瘤長徑<3 cm 10例，≥3 cm 30例；腫瘤侵犯程度T1～T2期17例，T3～T4期23例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，遠處轉(zhuǎn)移37例，TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期18例。對照組為15例健康體檢者，男8例、女7例，年齡(57.7±10.1)歲。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。本研究均取得患者知情同意和醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2外周血T淋巴細胞CD69、HLA-DR表達檢測采集觀察組術(shù)前、術(shù)后第5、10天和健康體檢者1次空腹外周靜脈血4 mL，肝素抗凝后備用(24 h內(nèi))。取3個流式試管編號，分別向試管中加入anti-CD3/CD4/IgG1、CD69、HLA-DR各5 μL，均加入50 μL抗凝全血，振蕩混勻，室溫避光孵育15 min后,加10%溶血素1 mL，振蕩混勻，室溫避光孵育12 min后離心(1 250 r/min)5 min，棄上清液，加入300 μL PBS，振蕩混勻后上流式細胞儀檢測(2 h內(nèi))CD69、HLA-DR的表達，以百分數(shù)表示，Cell Quest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1兩組手術(shù)前后外周血T淋巴細胞中CD69、HLA-DR表達比較觀察組CD69、HLA-DR表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，術(shù)后第5、10天CD69、HLA-DR表達水平較術(shù)前明顯升高(P均<0.05)。見表1。

表1　　　　兩組外周血T淋巴細胞中CD69、HLA-DR

注：與同組術(shù)前比較，*P<0.05；與對照組比較，○P<0.05。

2.2觀察組CD69、HLA-DR表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系圍手術(shù)期CD69、HLA-DR表達水平與性別、年齡、腫瘤生長部位、腫瘤侵犯程度無關(guān)(P﹥0.05)。腫瘤長徑<3 cm者術(shù)前HLA-DR表達水平明顯低于長徑≥3 cm者(P<0.05)；其余指標比較無統(tǒng)計學差異(P﹥0.05)。CD69表達不受有無遠處轉(zhuǎn)移影響(P﹥0.05)；術(shù)后有遠處轉(zhuǎn)移者HLA-DR表達明顯高于無遠處轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不同TNM分期主要影響術(shù)前CD69和整個圍手術(shù)期HLA-DR表達，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅰ～Ⅱ期CD69表達水平明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ～Ⅳ期(P﹥0.05)，而HLA-DR表達明顯低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ～Ⅳ期。見表2。

3討論

醫(yī)學研究認為腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移與免疫逃逸有關(guān)，活化后的T細胞發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視作用[3]。CD69是T淋巴細胞活化后表達最早的一種膜表面分子，活化后可進一步刺激T細胞增殖與活化，誘導Th1樣細胞因子的分泌,可間接殺傷腫瘤[4]，同時誘導HLA-DR表達。HLA-DR是主要組織相容抗原復合物MHC-Ⅱ類分子，被誘導/輔助T淋巴細胞識別，其不表達與低表達造成無法提呈腫瘤抗原，進一步無法誘導細胞毒性T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞等。

本研究觀察組術(shù)前外周血T淋巴細胞CD69、HLA-DR活化表達明顯低于對照組, 說明T細胞活化不足，難以執(zhí)行腫瘤免疫監(jiān)視作用，導致術(shù)前處于腫瘤免疫抑制狀態(tài)，更利于腫瘤生長浸潤和轉(zhuǎn)移。術(shù)后第5、10天CD69、HLA-DR表達水平均較術(shù)前明顯升高，說明機體在去瘤后可解除腫瘤源性的免疫抑制狀態(tài)。觀察組術(shù)前CD69表達水平在Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中更低，術(shù)后均逐漸升高，但仍未達到對照組水平。這可能是受手術(shù)及麻醉等因素影響造成術(shù)后免疫功能仍處于受損狀態(tài)，去瘤后誘導刺激T細胞活化的過程并非能立即恢復正常。HLA-DR在組織細胞中一般不表達或低表達，當腫瘤發(fā)生時，腫瘤細胞可分泌部分免疫抑制性細胞因子，如IL-10、TGF-β等，減弱腫瘤的排斥效應[5]，腫瘤細胞高表達FasL可通過FasL-Fas途徑介導腫瘤特異性T細胞凋亡[6]及腫瘤弱免疫原性抗原等免疫逃逸機制導致其免疫抑制，進而導致外周血HLA-DR水平低于正常人。但同時腫瘤細胞表面MHC分子開始表達，腫瘤抗原激活T細胞免疫，提高免疫監(jiān)視及誘導相關(guān)細胞毒性對抗腫瘤，有研究證實荷瘤機體免疫盡管受到抑制，活化的T輔助細胞CD4介導的細胞毒效應仍不斷進行[7]。本研究結(jié)果顯示觀察組分期較晚、腫瘤長徑較大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移時HLA-DR表達水平較高，但仍低于對照組。腫瘤免疫結(jié)構(gòu)能更好地預測患者預后[8～10],且手術(shù)去瘤、化療、放療和免疫治療均能觸發(fā)特異性抗腫瘤反應，改變腫瘤微環(huán)境，逆轉(zhuǎn)免疫抑制[11,12]。

表2　結(jié)直腸癌患者CD69、HLA-DR表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

綜上所述，被視為T細胞活化標志的CD69、HLA-DR在結(jié)直腸癌圍手術(shù)期表達水平能反映出機體免疫功能，檢測二者表達水平有助于判斷患者病情，進一步指導免疫治療。

參考文獻：

[1] 李健寧，徐忠法.結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究進展[J].山東醫(yī)藥，2015,55(25)：98-100.

[2] Simeoni L, Posevitz V, Kolsch U, et al. The transmembrane adapter protein SIT regulates thymic development and peripheral T-cell functions[J]. Mol Cell Biol, 2005,25(17):7557-7568.

[3] 王志剛，竇科峰.腫瘤免疫逃逸與轉(zhuǎn)化生長因子-β關(guān)系的研究進展[J].中華實驗外科雜志，2005,22(4)：511-512.

[4] Kawakami Y． Cancer treatment by comprehensive regulation of anti-tumor immune network[J]． Nihon Rinsho， 2010,68(6)：1094.

[5] Kacani L, Wurm M, Schennach H, et al. Immunosuppressive effects of soluble factors secreted by head and neck squamous cell carcinoma on dendritic cells and T lymphocytes[J]. Oral Oncol, 2003,39(7):672-679.

[6] Chouailb S, Thiery J, Gati A, et al. Tumor escape from killer inhibitory receptors and acquisition of tumor resistance to cell death[J]. Tissue Antigens, 2002,60(4):273-281.

[7] Yacyshyn MB, Poppema S, Berg A, et al. CD69+and HLA-DR+activion antigens on peripheral blood lymphocyte populations in metastatic breast and ovarian cancer patients: correlations with survival following active specific immunotherapy[J]. Int J Cancer, 1995,61(4):470.

[8] Mlecnik B, Tosolini M, Kirilovsky A, et al. Histopathologic-based prognostic factors of colorectal cancers are associated with the state of the local immune reaction [J]. J Clin Oncol, 2011,29(6)：610-618.

[9] Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, et al. Type, density , and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome[J]. Science, 2006,313(5795):1960-1964.

[10] 遲林,李昊淼.惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞亞群及Treg細胞檢測的臨床應用[J].山東醫(yī)藥,2010,50(32):59-60.

[11] Frederick DT, Piris A, Cogdill AP, et al. BRAF inhibition is associated with enhanced melanoma antigen expression and a more favorable tumor microenvironment in patients with metastatic melanoma[J]. Clin Cancer Res, 2013,19(5):1225-1231.

[12] Galluzzi L, Vacchelli E, Eggermont A, et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer immunotherapy[J]. Oncoimmunology, 2012,1(3):306-315.

Expression and significance of CD69 and HLA-DR in T lymphocytes of peripheral blood in perioperative period of patients with colorectal cancer

WANGXiang'an1,WUQiong,YULiming,ZOUZhenhong,CAILei,XIONGNi,YANGGang

(1TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expression changes and significance of CD69 and HLA-DR in T lymphocytes of peripheral blood in perioperative period of patients with colorectal cancer. MethodsFlow eytometry was used to detect the expression of CD69 and HLA-DR in T lymphocytes of peripheral blood in 40 cases of perioperative period (including the preoperative and postoperative 5, 10 days) of patients with colorectal cancer (observation group), and in 15 cases of healthy persons (control group). The relationship of their expression with clinicopathologic features was analyzed． ResultsThe expression of CD69 and HLA-DR before surgery was significantly lower in the observation group than that of the control group (P<0.05), with further increase after surgery (P<0.05). The expression of HLA-DR was related with lymph node metastasis, distant metastasis and TNM stage after surgery (P<0.05), but was not related with the rest of clinicopathologic features (all P>0.05).ConclusionsThe expression of CD69 and HLA-DR before surgery in T lymphocytes of peripheral blood in the perioperative period of patients with colorectal cancer was significantly decreased, and gradually increased after surgery. The detection of CD69 and HLA-DR contributes to determining the state of an illness and guiding immune therapy for colorectal cancer.

Key words:colorectal carcinoma; perioperative period; T lymphocytes; CD69; HLA-DR

(收稿日期：2015-11-14)

中圖分類號：R735.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)13-0007-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.003

通信作者簡介：楊剛(1957-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要研究方向為大腸癌基礎(chǔ)研究及診治。E-mail：ygrealtom@sohu.com

第一作者簡介：王祥安(1988-)，男，碩士，主要研究方向為胃腸道腫瘤研究及診治。E-mail：wangxiangan1988@163.com

基金項目：江西省衛(wèi)生廳科技計劃項目(20141081)。