快速檢測(cè)甜瓜西州蜜17號(hào)種子純度的SSR標(biāo)記

姜 陸 ， 盧浩， 王賢磊 ，寧雪飛，李 冠

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊　 830046)

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快速檢測(cè)甜瓜西州蜜17號(hào)種子純度的SSR標(biāo)記

姜 陸 ， 盧浩， 王賢磊 ，寧雪飛，李 冠

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

摘要：【目的】以甜瓜雜交品種西州蜜17號(hào)及其母本為材料，運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)雜交種與母本之間的擴(kuò)增譜帶的多態(tài)性進(jìn)行研究，篩選出一種能夠快速檢測(cè)雜種的SSR標(biāo)記?！痉椒ā吭谶x取的18個(gè)SSR標(biāo)記中，SSR標(biāo)記CMBR068在母本中擴(kuò)增出一條譜帶，在雜種中擴(kuò)增出兩條大小差異較大的譜帶，其中一條譜帶的大小與母本擴(kuò)增的譜帶大小一致?！窘Y(jié)果】利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)和CMBR068標(biāo)記對(duì)100粒雜交種子的純度進(jìn)行檢測(cè)，種子純度的鑒定結(jié)果為98%?！窘Y(jié)論】西州蜜17號(hào)甜瓜雜交種子的純度,可利用SSR標(biāo)記CMBR068,結(jié)合2.5%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：SSR標(biāo)記 ； 種子純度；甜瓜

0引 言

【研究意義】甜瓜西州蜜17號(hào)在我國新疆廣泛種植，因其口感佳，肉厚多汁而深受歡迎[1]。然而甜瓜的種子純度對(duì)于農(nóng)民的生產(chǎn)種植尤為重要，直接影響了甜瓜的品質(zhì)以及產(chǎn)量。在過去的十幾年里，建立起依賴于DNA分子標(biāo)記技術(shù)的種子純度鑒定方法，其中由于SSR標(biāo)記對(duì)DNA質(zhì)量的要求較低、用量少，能作為共顯性標(biāo)記具有多態(tài)性高等特性而被廣泛使用[2-4]。隨著2012年甜瓜測(cè)序的完成，大大降低了SSR標(biāo)記技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的難度[5]，與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，SSR標(biāo)記不易受環(huán)境因素影響，能夠更高效更準(zhǔn)確的對(duì)種子純度作出鑒定[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國內(nèi)外利用分子標(biāo)記鑒定甜瓜種子純度的報(bào)道已有許多，李菊芬等[7]篩選得到的12對(duì)SSR特異性引物可用于“東方蜜1號(hào)”中混雜的母本自交系雜種的鑒定，且鑒定的結(jié)果與大田結(jié)果一致；Yong等[8]運(yùn)用了412對(duì)微衛(wèi)星引物構(gòu)造了甜瓜的指紋圖譜，并且篩選出一對(duì)引物用于鑒別雜交后代種子中由于母本自花授粉產(chǎn)生的雜種；Gao P等[9]建立起鑒定甜瓜種子純度的DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)體系，并且構(gòu)建了471個(gè)甜瓜品種的QR代碼，有利于DNA指紋圖譜的閱讀和商業(yè)應(yīng)用。但SSR標(biāo)記在種子純度鑒定過程中依賴于聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，耗時(shí)長、成本高，針對(duì)該缺陷，篩選出在雜交后代池和母本池的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)多態(tài)性高的引物，用此引物進(jìn)行雜交后代種子純度的檢測(cè)[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】篩選出多態(tài)性較高的分子標(biāo)記，從而降低檢測(cè)成本，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，為實(shí)現(xiàn)甜瓜雜交種子純度在室內(nèi)快速經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)提供依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為西州蜜17號(hào)大田制種純度提供更高效、低成本的重要輔助工具。

1材料與方法

1.1材 料

供試材料為甜瓜西州蜜17號(hào)F1代雜交種及其母本種子；實(shí)驗(yàn)室篩選出的18對(duì)多態(tài)性高的SSR標(biāo)記作為引物，引物序列由上海生工有限公司合成，列出引物名稱。表1

表1所用引物編號(hào)及名稱
Table 1The No. and names of primers used in the experiment

引物編號(hào)PrimersNo.引物名稱Primersname引物編號(hào)PrimersNo.引物名稱Primersname123456789CMMS27-1TJ24CMN53-46CMBR120CMMS2-3CMBR068CMGAN3ECM134MU19101112131415161718CMN21-80ECM132SSR312-155ECM129ECM124CMN21-06CMCTN86TJ26CMMS22-2

1.2方 法

1.2.1 DNA的提取

將剝?nèi)シN皮的甜瓜種子首先于2% NaClO中處理8 min，然后于70%乙醇中處理30 s，再在2% NaClO中處理8 min，最后用無菌水沖洗4～5次，切下種子胚軸置于MS培養(yǎng)基中，取培養(yǎng)5～6 d子葉用于DNA的提取。將選好的子葉放入1.5 mL EP管中，加入鋼珠、700 μL CTAB于組織研磨機(jī)中40 HZ，180 s震蕩，充分研磨后于60℃水浴25～30 min(每10 min震蕩一次)。稍冷后加入700 μL氯仿/異戊醇=24∶1的混合液，震蕩200次混勻后12 000 r/min離心7 min,棄上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，加入500 μL異戊醇，顛倒混均后于室溫下沉淀10 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，于超凈工作臺(tái)風(fēng)干，最后加入30 μL ddH2O溶解DNA，保存于-20℃?zhèn)溆肹11]。

1.2.2 母本池和雜交后代池的構(gòu)建

從母本和雜交子代中分別選取15個(gè)個(gè)體，吸取等量的DNA混合，構(gòu)建親本池和雜交子代池[12]。

1.2.3 SSR多態(tài)性標(biāo)記的篩選與擴(kuò)增

SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：10×PCR Buffer(含 Mg2+)2 μL,1.5 mmol/L dNTP 0.4 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μl，引物 0.4 μL，DNA模板0.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：PCR擴(kuò)增在Bio-Red C1000 PCR儀上進(jìn)行，熱循環(huán)程序?yàn)椋?4°預(yù)變性1 min后，94°變性30 s，55°退火30 s，72°延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°延伸5 min，PCR產(chǎn)物于-20°冰箱保存。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1 甜瓜西州蜜17號(hào)種子純度鑒定的SSR引物篩選

18對(duì)SSR引物對(duì)甜瓜西州蜜17號(hào)母本池及其雜交后代池進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，引物CMBR068的擴(kuò)增結(jié)果中在雜交后代池和母本池之間有多態(tài)性且母本擴(kuò)增條帶為單帶，雜交后代擴(kuò)增條帶為雙帶，易于區(qū)分雜交種母本自交系，符合實(shí)驗(yàn)要求，因此可以利用引物CMBR068鑒定甜瓜西州蜜17號(hào)雜交種及其母本自交系。圖1

注：M為MarkerDL2000；泳道1、2分別為CMN21-06的母本和雜交子代擴(kuò)增結(jié)果；泳道3、4別為CMMS2-3的母本和雜交子代擴(kuò)增結(jié)果；泳道5、6分別為CMBR068的母本和雜交子代擴(kuò)增結(jié)果

Note：M：marker；1-2：The amplification of female and hybrid seed of Xizhoumi17by using CMN21-06 SSR marker；3-4：The amplification of female and hybrid seed of Xizhoumi17by using CMMS2-3 SSR marker；5-6：The amplification of female and hybrid seed of Xizhoumi17 by using CMBR068 SSR marker

圖1甜瓜雜交種西州蜜17號(hào)部分SSR引物篩選Fig.1 SSR primers selection in melon hybrid of Xizhoumi 17

2.2 甜瓜西州蜜17號(hào)種子純度的鑒定

使用CMBR068引物在甜瓜西州蜜17號(hào)雜交種的100粒種子中進(jìn)行群體驗(yàn)證的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)雜交種中出現(xiàn)雙帶的個(gè)數(shù)為98，結(jié)果表明，CMBR068標(biāo)記鑒定出甜瓜西州蜜17號(hào)100粒雜交種的純度為98%。圖2

注：M為MarkerDL2000；泳道1西州蜜17號(hào)母本；泳道2-24西州蜜17號(hào)雜交種

Note：M：Marker；1：The female of Xizhoumi 17；2-24：The hybrid seed of Xizhoumi 17

圖2引物CMBR068對(duì)甜瓜西州蜜17號(hào)雜交種及其母本的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2SSR profile of Xizhoumi 17(F1)hybrid and female parent amplifiedwith primer CMBR068

3討 論

目前對(duì)農(nóng)作物種子純度的檢測(cè)方法主要有兩種，分別為根據(jù)不同品種之間同工酶的差異和分子標(biāo)記技術(shù)鑒定農(nóng)作物種子純度。由于可以利用作物幼苗或者種子就可以進(jìn)行檢測(cè)，因此這兩種檢測(cè)方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各類農(nóng)產(chǎn)品種子純度的檢測(cè)[13，14]。

在甜瓜的雜交育種中，導(dǎo)致生產(chǎn)中的種子含有母本自交苗的原因主要是母本去雄不及時(shí)或者不徹底，實(shí)驗(yàn)篩選出的SSR標(biāo)記很容易鑒定出母本及其自交植株。并且篩選出的引物擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳可以進(jìn)行檢測(cè)，這種簡(jiǎn)單易行的電泳檢測(cè)技術(shù)在甜瓜雜交種純度的鑒定中是切實(shí)可行的。用此方法一個(gè)檢測(cè)人員可以在不到12 h的時(shí)間內(nèi)就可以完成100份樣品DNA的提取、PCR的擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，使甜瓜種子純度的室內(nèi)檢測(cè)更加經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確。

4結(jié) 論

通過利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)和CMBR068 SSR標(biāo)記對(duì)100粒雜交種子的純度進(jìn)行檢測(cè)，種子純度的鑒定結(jié)果為98%；甜瓜西州蜜17號(hào)雜交種子的純度可利用SSR標(biāo)記CMBR068結(jié)合2.5%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)，可取代聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，達(dá)到節(jié)時(shí)、降低檢測(cè)成本的目的。

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SSR Marker for Rapid Detection of Xizhoumi 17 Muskmelon's Seed Purity

JIANG Lu，LU Hao，WANG Xian-lei，NING Xue-fei，LI Guan

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Abstract：【Objective】 In order to screen out one SSR marker to detect seed purity, the melon hybrids of Xizhoumi 17 and its female lines were used to study the polymorphorrism of amplifiable spectral bands.【Method】Among the 18 pairs of SSR primers, one pair of SSR primer (CMBR068) which was amplified had significant difference in size between hybrids and its female.【Result】The purity of 100 hybrid seed was identified and the result showed the purity of hybrid seeds was 98%.【Conclusion】 Purity of Xizhoumi 17 hybrid seed could be detected rapidly by using this method.

Key words:SSR molecular marker；seed purity；melon

中圖分類號(hào)：S662

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-4330(2016)03-0407-04

作者簡(jiǎn)介:姜陸(1992-)，女，新疆人，碩士，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)，(E-mail)762547732@qq.com通訊作者:李冠(1949-)，男，湖北人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锷砩c分子生物學(xué),(E-mail)guanli@xju.edu.cn

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3126025)

收稿日期：2015-11-02

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.003

Fund project:Project supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.3126025)