利用響應(yīng)面法優(yōu)化海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)角鯊烯的研究*

王曉龍， 譚延振， 候路寬， 崔　球,4， 宋曉金, 李文利,**

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,醫(yī)藥學(xué)院,山東 青島 266003；

2.青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；

3.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；

4.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101)

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利用響應(yīng)面法優(yōu)化海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)角鯊烯的研究*

王曉龍1， 譚延振2,3， 候路寬1， 崔球2,3,4， 宋曉金2,3, 李文利1,**

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,醫(yī)藥學(xué)院,山東 青島 266003；

2.青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；

3.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；

4.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101)

摘要：采用響應(yīng)面法對(duì)海洋微生物Pseudozyma sp. SD301發(fā)酵產(chǎn)角鯊烯培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)葡萄糖濃度、接種量、培養(yǎng)溫度、裝液量進(jìn)行4因素響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以角鯊烯產(chǎn)量為響應(yīng)值，優(yōu)化菌株P(guān)seudozyma sp. SD301的培養(yǎng)條件，并驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的一致性。結(jié)果表明，在葡萄糖濃度為67.2 g·L(-1)、接種量為1.5%、培養(yǎng)溫度為26℃、裝液量在41 mL/250 mL的最優(yōu)培養(yǎng)條件下，角鯊烯產(chǎn)量為1.152 g·L(-1)，比出發(fā)條件提高了3.62倍，實(shí)測(cè)值與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值吻合良好。

關(guān)鍵詞:角鯊烯；發(fā)酵優(yōu)化；Plackett-Burman；響應(yīng)面優(yōu)化

引用格式：王曉龍， 譚延振， 候路寬， 等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)角鯊烯的研究[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)(自然科學(xué)版)， 2016, 46(4)： 89-95.

WANG Xiao-Long, TAN Yan-Zhen, HOU Lu-Kuan, et al.Optimization of fermentation conditions for squalene production by marine microbe using response surface methodology[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(4): 89-95.

角鯊烯(Squalene)是一種脂質(zhì)不皂化物，其化學(xué)名稱為2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六烯，屬開(kāi)鏈三萜。具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善機(jī)體功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能[1]，是一種無(wú)毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物質(zhì)，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、美容、化妝品、食品等各個(gè)領(lǐng)域[2]。

角鯊烯擁有廣闊的應(yīng)用前景，然而稀缺的來(lái)源極大地限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和普及使用。目前深海鯊魚(yú)是市場(chǎng)獲取角鯊烯的主要途徑[3]。但是深海鯊魚(yú)是珍貴的海洋保護(hù)生物，大量捕殺會(huì)破壞海洋生態(tài)平衡，而且從鯊魚(yú)肝油中提取角鯊烯存在高成本及安全衛(wèi)生問(wèn)題。從植物獲取角鯊烯雖然來(lái)源廣泛，但是植物中角鯊烯含量低，而且植物產(chǎn)量深受季節(jié)和地域的影響[4]?？傊烊粊?lái)源角鯊烯已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求和質(zhì)量要求，工業(yè)化生產(chǎn)角鯊烯勢(shì)在必行。目前來(lái)說(shuō)化學(xué)合成方法都存在不同程度的問(wèn)題，不是歩驟過(guò)多、反應(yīng)復(fù)雜；就是反應(yīng)條件苛刻，條件實(shí)現(xiàn)難度大，化學(xué)合成角鯊烯目前僅限于實(shí)驗(yàn)室的研究，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化合成尚有距離[5]。所以解決角鯊烯來(lái)源的瓶頸問(wèn)題，急需從微生物及其他方向上尋求突破[6]。

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。利用微生物生產(chǎn)角鯊烯產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)質(zhì)、生產(chǎn)周期短、不受時(shí)間地域限制、生產(chǎn)工藝操作簡(jiǎn)單、安全衛(wèi)生，是工業(yè)生產(chǎn)角鯊烯的最佳選擇。因而利用微生物發(fā)酵獲取優(yōu)質(zhì)而廉價(jià)角鯊烯成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)。其中破囊壺菌、微藻、酵母及類酵母是目前研究的重點(diǎn)。據(jù)報(bào)道在光合自養(yǎng)的條件下，一些微藻可以積累一定量的角鯊烯[7]，異養(yǎng)微藻Thraustochytrid也可以具有較高的角鯊烯含量，達(dá)到1.2mg·g-1[8]。菌株Aurantiochytriumsp.18W-13a是分離于日本沖繩的高產(chǎn)角鯊烯菌株，其產(chǎn)量可高達(dá)(1.29±0.13)g·L-1，是目前已知的角鯊烯產(chǎn)量最高菌株[9]。Elias Englund等[10]研究結(jié)果表明Synechocystissp.PCC 6803可以高效積累角鯊烯，拓寬了角鯊烯微生物來(lái)源的研究范圍。眾所周知基因工程改造是提高微生物產(chǎn)角鯊烯能力的重要手段。Garaiová M等[11]通過(guò)基因工程手段顯著改變釀酒酵母產(chǎn)角鯊烯能力，突顯出基因工程在改良菌株方面的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。Akinori Katabami等[12]人通過(guò)在EscherichiaColi中表達(dá)角鯊烯合酶，實(shí)現(xiàn)了角鯊烯在大腸桿菌中的表達(dá)，角鯊烯達(dá)到230mg·L-1。酵母及類酵母是本領(lǐng)域內(nèi)已知的產(chǎn)角鯊烯量高的微生物，釀酒酵母、畢赤酵母、有孢圓酵母生產(chǎn)角鯊烯已被廣泛研究。Pseudozymasp.JCC207是一株分離自美國(guó)近海的類酵母菌株，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以高效生產(chǎn)角鯊烯，在優(yōu)化條件下角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到340.52mg·L-1，顯示出其巨大的工業(yè)潛力[13]。

研究室前期分離獲得一株可以產(chǎn)角鯊烯的類酵母菌株。利用Plackett-Burman與響應(yīng)面方法優(yōu)化其產(chǎn)角鯊烯的發(fā)酵條件，建立其高產(chǎn)角鯊烯的工藝方法。采用Plackett-Burman法可以通過(guò)較少的試驗(yàn)次數(shù)，快速準(zhǔn)確地從眾多變量間篩選出對(duì)響應(yīng)值有顯著效應(yīng)的因素，有效減少試驗(yàn)考察因素及試驗(yàn)次數(shù)。響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology, RSM)是一種在微生物發(fā)酵領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用的優(yōu)化方法，其可以形象直接的顯示最優(yōu)區(qū)域及最優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面方法確定重要因素的最佳水平，利用Design expert軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出回歸模型和最佳發(fā)酵條件，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。最終得到利用Pseudozymasp. SD301發(fā)酵產(chǎn)角鯊烯的最佳發(fā)酵條件，為海洋微生物產(chǎn)角鯊烯工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

Pseudozymasp. SD301菌株由中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所代謝物組學(xué)團(tuán)隊(duì)研究室分離獲得，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CGMCC No. 9687。種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1，酵母抽提物20 g·L-1，海水晶15 g·L-1；固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g·L-1。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖60 g·L-1，酵母抽提物20 g·L-1，海水晶15 g·L-1。

菌株劃線于固體平板，25℃培養(yǎng)2d，接種于裝有一定體積的種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在25℃，200r·min-1的搖床培養(yǎng)一定時(shí)間后，種子液按一定比例接種至裝有一定體積的發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于選定溫度及轉(zhuǎn)速的搖床上培養(yǎng)一定時(shí)間后，取發(fā)酵液30mL，4000g離心10min，收集菌體，菌體進(jìn)行冷凍干燥稱重并分析角鯊烯含量。

1.2 角鯊烯的提取

角鯊烯的提取參照He[14]等的方法。將菌體磨碎后稱取適量菌體(約60 mg)，加入300μL 6mol·L-1HCl，室溫放置30 min，沸水浴5 min。冷卻后的溶液中加入900 μL氯仿甲醇(2∶1, v/v)，渦旋振蕩混勻，12000r·min-1離心5 min，收集下層液體，加入等體積飽和氯化鈉，離心取下相。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，50℃真空干燥，得到油脂。加入2mol·L-1NaOH溶液，85℃反應(yīng)1h，使油脂中的脂肪酸完全皂化。冷卻至室溫，加入適量飽和NaCl溶液和正己烷，振蕩并靜置分層。上相用0.22μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3 角鯊烯含量分析

氣相色譜條件為：采用Agilent 7890B氣相色譜，色譜柱型號(hào)為HP-5柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣為高純氮?dú)?，恒流模式，流?.0mL·min-1；進(jìn)樣體積為1μL，檢測(cè)器為氫離子火焰檢測(cè)器。升溫程序?yàn)椋撼鯗?00℃，以15℃·min-1升至300℃，保持6min。

角鯊烯(99%，J&K Scientific LTD)溶于色譜級(jí)正己烷，做響應(yīng)峰面積-角鯊烯含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)。根據(jù)待測(cè)樣品中角鯊烯的響應(yīng)峰面積測(cè)定角鯊烯含量。

圖1　角鯊烯濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

角鯊烯產(chǎn)量計(jì)算公式：

Y=X×Z-1×M×0.03。

其中:Y為角鯊烯產(chǎn)量，單位 g·L-1；X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的角鯊烯質(zhì)量，單位g；Z為研磨后稱取的菌體干重，單位g；M為每次取樣(30mL)中菌體干重，單位g；0.03，為常數(shù)，表示每次取樣的體積，L。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參照Plackett的方法[15-16]。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定影響角鯊烯發(fā)酵的可能因素，對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行全面考察，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中把每個(gè)因素設(shè)計(jì)成高(+1)和低(-1)2個(gè)水平。

1.4.2 中心組合實(shí)驗(yàn)中心組合實(shí)驗(yàn)參照Adinarayana等的方法[17-19]。采用中心組合設(shè)計(jì)(Central composite design, CCD)，對(duì)PB實(shí)驗(yàn)篩選到的關(guān)鍵因子進(jìn)一步研究，以獲得影響該菌發(fā)酵產(chǎn)角鯊烯的優(yōu)化發(fā)酵條件。自變量按下式進(jìn)行編碼變換：

Xi=(x-x0)/Δxi，i=1, 2, 3, …, K。

(1)

式中：Xi為自變量xi的編碼值，x0為自變量Xi在中心點(diǎn)的值，Δxi為自變量變化步長(zhǎng)。用標(biāo)準(zhǔn)多項(xiàng)式回歸方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，便得到一個(gè)二次多項(xiàng)式，該方程為描述響應(yīng)量(應(yīng)變量)自變量關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?duì)于2因子系統(tǒng)，模型可描述為:

(2)

式中：Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值；β0為截距；βi為線性系數(shù)；βii為平方系數(shù)；βij為交互作用系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1 影響角鯊烯發(fā)酵的重要因素

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定影響角鯊烯發(fā)酵的可能因素包括葡萄糖濃度、酵母抽提物濃度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、轉(zhuǎn)速、裝液量、瓶型9個(gè)因素。為了對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行全面考察，設(shè)計(jì)進(jìn)行了Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中把每個(gè)因素設(shè)計(jì)成高(+1)和低(-1)2個(gè)水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

注：各符號(hào)表示含義X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X2，酵母抽提物含量(g·L-1)；X3，培養(yǎng)時(shí)間(day)；X4，培養(yǎng)基初始pH值；X5，培養(yǎng)溫度(℃)；X6，初始接種量(%，V/V)；X7，轉(zhuǎn)速(rpm)；X8，裝液量(mL)；X9,瓶型。X1，Glucose concention(g·L-1);X2，Yeast extract concention(g·L-1); X3，Culture time(day); X4， Initial pH; X5， Culture temperature; X6， Inocultion quantity; X7， Rotate speed; X8， Loding; X9, Bottle type.

按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行2輪重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每輪設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果取6次平均值，見(jiàn)表1中角鯊烯含量一欄。利用Design expert軟件進(jìn)行分析各因素效益及重要性評(píng)價(jià)(見(jiàn)表2)。

對(duì)角鯊烯發(fā)酵過(guò)程有顯著影響(可信度大于75%，P<0.25)的因素包括葡萄糖含量、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度。其中葡萄糖、接種量、裝液量呈現(xiàn)正效應(yīng)，培養(yǎng)溫度呈現(xiàn)副效應(yīng)。葡萄糖、接種量對(duì)角鯊烯發(fā)酵具呈現(xiàn)正效應(yīng)顯著影響，這是因?yàn)榻酋徬儆诎麅?nèi)產(chǎn)物，其生物量能夠直接顯著影響其產(chǎn)物產(chǎn)量。同樣，在溫度超過(guò)其最適溫度后，高溫對(duì)其產(chǎn)生不良影響，抑制菌體生長(zhǎng)，所以表現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)顯著影響。而裝液量能夠影響角鯊烯產(chǎn)量的原因可能是過(guò)少的裝液量造成過(guò)高的溶氧，使得胞內(nèi)碳流向能量代謝等途徑轉(zhuǎn)移，最終影響角鯊烯產(chǎn)量。其余因素如初始pH值和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)角鯊烯產(chǎn)量沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明本研究中使用的菌株具有良好低pH耐受性和生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

綜合Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，要提高產(chǎn)角鯊烯產(chǎn)量，應(yīng)該適當(dāng)提高葡萄糖濃度、裝液量和初始接種量，降低培養(yǎng)溫度。各個(gè)因素最優(yōu)值有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考察。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

2.2.1 模型的建立及分析按照數(shù)理統(tǒng)計(jì)的原理及分析的方法，參照Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響最顯著的4個(gè)因素，葡萄糖、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度作為研究因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以角鯊烯產(chǎn)量做為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照二次項(xiàng)回歸方程進(jìn)行擬合，進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)。變量及每個(gè)水平對(duì)應(yīng)值見(jiàn)表3。中心組合及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表2　各因素的主要效應(yīng)

表 3　中心組合實(shí)驗(yàn)中變量及其水平

注：各符號(hào)表示含義X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X5，培養(yǎng)溫度(℃)；X6，初始接種量(%，V/V)；X8，裝液量(mL)。X1，Glucose concention(g·L-1); X5， Culture temperature(℃); X6， Inocultion quantity(%,v/v); X8， Loding(mL).

2.2.2 多元二次回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn)應(yīng)用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合[20-21]對(duì)中心組合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得葡萄糖(X1)、培養(yǎng)溫度(X5)、接種量(X6)、裝液量(X8)與響應(yīng)值角鯊烯產(chǎn)量(Y)的關(guān)系，其方程式為：

Y=0.12X1+0.047X5+0.0083X6+0.061X8+0.018X1X5+0.013X1X6-0.071X1X8-0.021X5X6-0.005X5X8-0.00199X6X8-0.12X12-0.18X52-0.086X62-0.13X82

回歸方差分析見(jiàn)表5，結(jié)果表明：模型決定系數(shù)R2=0.9678，葡萄糖(X1)、培養(yǎng)溫度(X5)、接種量(X6)、裝液量(X8)與響應(yīng)值角鯊烯產(chǎn)量(Y)存在線性關(guān)系；F值為7.03(P<0.0005)，說(shuō)明此模型高度顯著。因素葡萄糖(X1)對(duì)角鯊烯產(chǎn)量效應(yīng)顯著，培養(yǎng)溫度(X5)、裝液量(X8)次之，接種量(X6)幾乎無(wú)影響;因素X1與X5對(duì)角鯊烯發(fā)酵交互作用顯著，而其他因素兩兩交互影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)發(fā)酵條件的確定及驗(yàn)證借助Design expert軟件依據(jù)回歸方程來(lái)繪制響應(yīng)面立體分析圖，考察所擬合的相應(yīng)曲面的形狀響應(yīng)面立體圖如圖2所示。利用該組圖可以對(duì)影響角鯊烯的發(fā)酵條件中2種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，并確定最佳因素水平范圍。

圖2A顯示葡萄糖和培養(yǎng)溫度之間交互影響的響應(yīng)面圖。在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，角鯊烯產(chǎn)量會(huì)隨著葡萄糖的濃度和培養(yǎng)溫度的取值水平而變化。當(dāng)葡萄糖的濃度小于67g·L-1時(shí)，角鯊烯產(chǎn)量隨葡萄糖濃度升高而升高，當(dāng)葡萄糖的濃度大于67g·L-1時(shí)，無(wú)論培養(yǎng)溫度為多少，角鯊烯產(chǎn)量都不會(huì)達(dá)到最大值。因此葡萄糖濃度應(yīng)該控制在60～70g·L-1之間。培養(yǎng)溫度變化趨勢(shì)與葡萄糖濃度相似，比較適宜的培養(yǎng)溫度在24～28℃之間。

圖2B培養(yǎng)溫度與裝液量對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響。由圖可見(jiàn)，培養(yǎng)溫度及裝液量的變化對(duì)角鯊烯產(chǎn)量影響非常明顯。前期隨著培養(yǎng)溫度的升高，角鯊烯產(chǎn)量不斷增加，到達(dá)峰值25℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，角鯊烯產(chǎn)量逐漸減少；與之類似，前期隨著裝液量的增加，角鯊烯產(chǎn)量不斷增加，到達(dá)峰值約40mL時(shí)，隨著裝液量的升高，角鯊烯產(chǎn)量逐漸減少。因此，培養(yǎng)溫度在24～28℃，裝液量在40～45mL之間時(shí)，角鯊烯產(chǎn)量最高。

圖2C顯示葡萄糖與裝液量之間交互影響效應(yīng)的響應(yīng)面圖。由圖可見(jiàn)，在角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到峰值前，葡萄糖濃度及裝液量的變化對(duì)角鯊烯產(chǎn)量影響非常明顯。隨著葡萄糖濃度的增加，角鯊烯產(chǎn)量不斷增加；裝液量增加，角鯊烯產(chǎn)量提高。但當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到約67g·L-1后，增加葡萄糖濃度不能提高角鯊烯產(chǎn)量；與之相對(duì)，當(dāng)裝液量在約40mL后，增加裝液量會(huì)使角鯊烯產(chǎn)量略微減少。因此，控制葡萄糖濃度在60～70g·L-1，裝液量在40～45mL之間時(shí)，角鯊烯產(chǎn)量最高。

表4　中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

注：各符號(hào)表示含義X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X5，培養(yǎng)溫度(℃)；X6，初始接種量(%，V/V)；X8，裝液量(mL)。X1，Glucose concention(g·L-1); X5， Culture temperature(℃); X6， Inocultion quantity(%,v/v); X8， Loding(mL).

表5　角鯊烯二次多項(xiàng)模型的方差分析表

(A.葡萄糖與培養(yǎng)溫度對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響；B.培養(yǎng)溫度與裝液量對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響；C.葡萄糖與裝液量對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響；D.葡萄糖與接種量對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響。The effects on Squalene yield by different factorsa A.Glucose concentration and culture temperature; B.Temperature and loadings; C.Glucose concentration and loadings; D.Glucose concentation and inoculation quantity.)

圖22種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)

Fig.2The interaction effects of two factors

圖2D顯示葡萄糖與接種量之間響應(yīng)曲面圖。由此圖可知，葡萄糖及接種量的變化對(duì)角鯊烯產(chǎn)量影響明顯。前期隨著葡萄糖濃度的升高，角鯊烯產(chǎn)量不斷增加，到達(dá)峰值67 g·L-1時(shí)，隨著葡萄糖濃度升高，角鯊烯產(chǎn)量略微減少；與之類似，前期隨著接種量的增加，角鯊烯產(chǎn)量不斷增加，到達(dá)1.5%時(shí)，隨著接種量的增加，角鯊烯產(chǎn)量逐漸減少。因此葡萄糖濃度在60～70 g·L-1，接種量比例在1.4%～1.6%之間時(shí)，角鯊烯產(chǎn)量最高。

綜上所述，低水平或高水平的影響因素都不利于角鯊烯產(chǎn)量的提高，當(dāng)葡萄糖濃度在60～70 g·L-1，培養(yǎng)溫度在24～28℃，接種量比例在1.4%～1.6%之間，裝液量在40～45 mL/250 mL，角鯊烯產(chǎn)量最高。當(dāng)濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致角鯊烯產(chǎn)量下降。

從圖2中可直觀地看出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)，并且回歸模型存在最大值。在葡萄糖濃度為67.2 g·L-1、接種量為1.5%、培養(yǎng)溫度為26℃、裝液量在41 mL/250 mL的最優(yōu)培養(yǎng)條件下角鯊烯產(chǎn)量理論最大值可達(dá)1.1508 g·L-1。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，所得角鯊烯產(chǎn)量為1.1520 g·L-1，這與響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)結(jié)果十分接近，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

3討論

角鯊烯即三十碳六烯，屬于脂質(zhì)不皂化物，具有眾多重要的生理活性。目前，角鯊烯多從鯊魚(yú)肝臟提取。日益嚴(yán)重的環(huán)境污染使其難以保證質(zhì)量安全，同時(shí)，大量捕撈鯊魚(yú)也會(huì)造成資源枯竭，加劇生態(tài)破壞。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯，既可以避免質(zhì)量不可控的風(fēng)險(xiǎn)，也能保護(hù)生態(tài)資源，因此，微生物生產(chǎn)角鯊烯越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯不僅可以解決角鯊烯來(lái)源問(wèn)題，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益；同時(shí)推動(dòng)角鯊烯的普及，產(chǎn)生良好的社會(huì)效應(yīng)。與此同時(shí)，間接保護(hù)深海鯊魚(yú)，維護(hù)海洋生態(tài)平衡。目前，微生物發(fā)酵工藝日益成熟，角鯊烯生產(chǎn)菌株開(kāi)發(fā)突飛猛進(jìn)，微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯前景廣闊。

本研究室前期從近海淤泥中分離篩選獲得了一株可以產(chǎn)角鯊烯的類酵母。本文就是在此基礎(chǔ)上，對(duì)該類酵母的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯優(yōu)化工藝。前期實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)基成分中的葡萄糖濃度和酵母抽提物濃度；發(fā)酵培養(yǎng)中的初始pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、瓶型和培養(yǎng)時(shí)間都會(huì)對(duì)角鯊烯的產(chǎn)量產(chǎn)生影響。為了確定以上九個(gè)因素對(duì)角鯊烯發(fā)酵生產(chǎn)的影響開(kāi)展了本研究。首先采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，篩選出來(lái)影響角鯊烯生產(chǎn)的顯著因素。其中，酵母抽提物、初始pH值、瓶型、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間影響均不顯著。瓶型和轉(zhuǎn)速是通過(guò)溶氧影響角鯊烯合成途徑和生物量，在本研究條件下，可能是發(fā)酵過(guò)程對(duì)溶氧需求不高，造成以上兩個(gè)條件影響不顯著；初始pH值影響不顯著，說(shuō)明菌株具有較為廣泛的pH適應(yīng)性；酵母抽提物影響不顯著，而葡萄糖影響顯著，說(shuō)明生物量能顯著影響角鯊烯產(chǎn)量，但碳氮比對(duì)角鯊烯產(chǎn)量影響有限；Pseudozymasp. SD301菌株在培養(yǎng)4～6天時(shí)一直處于穩(wěn)定期，發(fā)酵體系的代謝水平處于穩(wěn)定狀態(tài)，所以對(duì)角鯊烯的總生產(chǎn)量影響不顯著。

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化篩選得到的顯著因素。采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件可以將函數(shù)關(guān)系運(yùn)用圖形技術(shù)顯示，憑借直覺(jué)觀察其最優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)然響應(yīng)面優(yōu)化需要一定的前期工作基礎(chǔ)。結(jié)果顯示接種量-裝液量；接種量-葡萄糖；接種量-培養(yǎng)溫度交互效應(yīng)影響角鯊烯產(chǎn)量均不明顯。這可能是因?yàn)榻臃N量在跨度較大時(shí)，可較為明顯影響角鯊烯產(chǎn)量，所以在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)中成為顯著因素；在中心組合中，接種量跨度減小，其對(duì)角鯊烯產(chǎn)量影響減小，不顯著。因而，可以得到結(jié)論：在發(fā)酵類酵母Pseudozymasp.SD301生產(chǎn)角鯊烯時(shí)，接種量大致控制在1.5%左右即可，不需要很嚴(yán)格控制，這也更加利于工業(yè)生產(chǎn)操作。

通過(guò)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量是影響角鯊烯發(fā)酵的顯著因素。優(yōu)化后發(fā)酵條件為:葡萄糖濃度為67.2 g·L-1、接種量為1.5%、培養(yǎng)溫度為26℃、裝液量在41 mL/250 mL。利用優(yōu)化得到的理論最優(yōu)發(fā)酵條件，進(jìn)行250 mL搖瓶發(fā)酵，角鯊烯的產(chǎn)量為1.152 g·L-1，與響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)值相吻合。這一結(jié)果比未優(yōu)化時(shí)的產(chǎn)量提高362%。說(shuō)明該菌株具有潛力成為生產(chǎn)角鯊烯的工業(yè)菌株，響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件卓有成效。本實(shí)驗(yàn)為搖瓶水平實(shí)驗(yàn)，相信通過(guò)上罐發(fā)酵優(yōu)化，優(yōu)化培養(yǎng)基組成，特別是控制溶氧等手段可進(jìn)一步提高角鯊烯產(chǎn)量。本研究為工業(yè)化海洋微生物產(chǎn)角鯊烯提供了菌株和發(fā)酵工藝，也為下一步發(fā)酵優(yōu)化提供了工作基礎(chǔ)。

致謝:感謝馮銀剛研究員在文章修改過(guò)程中給予的寶貴指導(dǎo)；感謝馬增新博士在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予的大力幫助。

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責(zé)任編輯徐環(huán)

技術(shù)報(bào)告

Optimization of Fermentation Conditions for Squalene Production by Marine Microbe Using Response Surface Methodology

WANG Xiao-Long1, TAN Yan-Zhen2,3, HOU Lu-Kuan1, CUI Qiu2,3,4, SONG Xiao-Jin2,3, LI Wen-Li1

(1. The Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education, School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2.Qingdao Engineering Laboratory of Single Cell Oil, Qingdao 266101, China；3.Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China；4.The Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China)

Abstract:Fermentation conditions for squalene production by marine microbe Pseudozyma sp. SD301 were optimized in shake flask using response surface methodology (RSM). Based on the results obtained from the single factor tests, response surface analysis was designed with Design-Expert. The effects of glucose concentration, inoculation quantity, culture temperature and loading quantity on the yield of squalene were studied using RSM.By the central composite design,a predictive polynomial quadratic model was set up and the optimum fermentation conditions were developed.The theoretical optimal culture conditions are as follows: concentration of glucose was 67.2 g·L(-1)， inoculation quantity was 1.5% (v/v), culture temperature was 26 ℃, loading quantity was 41 mL in a 250 mL flask. Under these conditions, the yield of squalene reached 1.152g·L(-1), which is consistent with the predicted value of 1.1508 g·L(-1), representing a 3.62-fold increase compared to the original conditions.

Key words:squalene； fermentation optimization； plackett-burman； response surface methodology

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20140443

中圖法分類號(hào)：Q936

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5174(2016)04-089-07

作者簡(jiǎn)介：王曉龍(1989-)，男，碩士生。E-mail：wangxiaolong1022@126.com**通訊作者：E-mail：liwenli@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-01-07；

修訂日期：2015-03-25

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31171201);國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(41306132)資助

Supported by the National Natural Science Foundation of China (31171201,41306132)