快速核酸提取環(huán)介導等溫擴增檢測技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應用評價

歐喜超 夏輝 李強 逄宇 趙冰 張治英 李俊晨 趙雁林

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快速核酸提取環(huán)介導等溫擴增檢測技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應用評價

歐喜超 夏輝 李強 逄宇 趙冰 張治英 李俊晨 趙雁林

目的 評估快速核酸提取環(huán)介導等溫擴增檢測(PURE-LAMP)技術(shù)在肺結(jié)核臨床診斷中的應用價值。方法 選取2012年4月至2013年1月在河南省新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所和獲嘉縣疾病預防控制中心就診的初診肺結(jié)核可疑癥狀者作為研究對象，共1378例。每例患者留取3份痰標本，分別進行痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測。以臨床診斷結(jié)果為標準，比較痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP法檢測MTB的效能；以固體培養(yǎng)試驗結(jié)果為標準，評估PURE-LAMP檢測MTB的效能。結(jié)果 以臨床診斷結(jié)果為標準，痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測MTB的敏感度分別為23.40%(168/718)、58.91%(423/718)和49.44%(355/718)。PURE-LAMP檢測敏感度高于痰涂片鏡檢(χ2=185.02，P=0.000)，但低于固體培養(yǎng)試驗(χ2=46.24，P=0.000)。以固體培養(yǎng)試驗結(jié)果為標準，PURE-LAMP檢測MTB的敏感度和特異度分別為90.24%(333/369)和96.86%(924/954)，涂陰患者中檢測敏感度和特異度分別為82.52%(170/206)和97.06%(924/952)。結(jié)論 PURE-LAMP檢測操作簡單，敏感度和特異度較高，在我國縣(區(qū))級結(jié)核病防治機構(gòu)具有一定的應用前景。

分枝桿菌，結(jié)核； 核酸擴增技術(shù)； 診斷

傳統(tǒng)的結(jié)核病實驗室診斷方法中，涂片顯微鏡檢查敏感度較低，雖然固體培養(yǎng)具有較高的敏感度，但是獲得實驗結(jié)果至少需要3～8周，耗時較長。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，近年來涌現(xiàn)出許多可用于MTB快速診斷及鑒定的方法[1-2]。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)在等溫條件下可高效、快速、高特異地擴增靶核苷酸序列[3]。Iwamoto等[4]針對MTB的gyrB基因設計6條種屬特異性引物，將LAMP技術(shù)應用到MTB復合群的檢測。2010年，研發(fā)者通過對MTB核酸提取和LAMP檢測技術(shù)進行優(yōu)化設計，研制出MTB快速核酸提取環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒(PURE-LAMP)，平均手工操作時間為40 min，接近于涂片鏡檢所需時間，通過使用封閉裝置進行核酸提取，并且擴增反應和結(jié)果判讀在一個加熱裝置內(nèi)即可完成，操作方便并降低了污染發(fā)生的可能性。為探討該方法在區(qū)縣級結(jié)核病實驗室推廣應用的可行性，筆者選取河南省新鄉(xiāng)市和獲嘉縣作為研究現(xiàn)場，通過與臨床診斷結(jié)果和固體培養(yǎng)試驗結(jié)果比較，評價PURE-LAMP方法在臨床樣本中檢測MTB的效能。

材料和方法

1. 研究對象：選取2012年4月至2013年1月在河南省新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所和獲嘉縣疾病預防控制中心就診的初診肺結(jié)核可疑癥狀者作為研究對象，共1378例。由接受過培訓的臨床醫(yī)生詳細詢問研究對象的一般信息、本次就診癥狀及病史，逐項確認后填寫臨床信息表。每例患者留取3份痰標本，分別進行涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測。

2. 痰涂片檢查：涂片檢查遵照《痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》[7]中的標準化操作程序執(zhí)行。

3. 固體培養(yǎng)：簡單法固體培養(yǎng)試驗遵照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[8]中的標準化操作程序執(zhí)行。

4. PURE-LAMP檢測：使用移液器將60 μl痰液和陰性對照加入到加熱管內(nèi)，將加熱管在PURE-LAMP反應儀后端的加熱模塊于90 ℃加熱5 min后，取出加熱管并將其用力旋入吸附管，擰緊并充分混合。取出注射帽，將其推入吸附管，旋緊固定，此裝置即為LAMP反應純化裝置。持續(xù)擠壓純化裝置的吸附管，滴加反應液至含有擴增試劑的反應管的兩個刻度線之間，所有核酸樣本和陰性對照均加入到反應管后，使用毛細管吸取30 μl陽性對照液到PURE-LAMP反應管。蓋緊反應管并倒置2 min，使干燥的PURE-LAMP試劑與反應液充分混合。然后將反應管放置到反應儀前端的反應模塊中。當反應模塊溫度達到(67±0.5) ℃后，按下右側(cè)反應模塊計時開關(guān)，開始LAMP反應，反應時間為40 min。反應結(jié)束后取出反應管，放入熒光檢測模塊，如果陽性對照管顯示熒光而陰性對照管沒有熒光，則觀察各樣品是否有熒光顯示，有熒光顯示為陽性，沒有熒光顯示為陰性；否則為檢測失敗，需要重復檢測。

5.菌群鑒定：培養(yǎng)陽性菌株進行16S～23S rDNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)測序分析，區(qū)分MTB和NTM。上游引物為5′-GGCCTAACCCTCGGGAGGGAG-3′，下游引物為5′-CCCGAGGCATATCGCAGCCTC-3′。測序引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用PCR直接測序法，在ABI PRISM 377DNA自動測序儀上對擴增產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行比對分析。

6. 臨床診斷及隨訪：患者就診時，臨床醫(yī)生根據(jù)痰涂片、X線胸片和臨床檢查結(jié)果對納入患者進行診斷(PURE-LAMP檢測作為評估技術(shù)不能用于患者診斷)，對確診肺結(jié)核患者開始抗結(jié)核治療。對PURE-LAMP陰性排除肺結(jié)核者于2個月后進行隨訪。隨訪時除詢問患者就診癥狀外，還要進行胸部X線攝片復查，并收取患者痰標本進行涂片鏡檢。2個月末，根據(jù)初診痰涂片、固體培養(yǎng)、PURE-LAMP檢測和臨床檢查結(jié)果，將納入患者分為5類：涂陽肺結(jié)核、涂陰培陽肺結(jié)核、涂陰培陰臨床診斷肺結(jié)核、LAMP陽性排除肺結(jié)核和LAMP陰性排除肺結(jié)核。涂陰培陰臨床診斷肺結(jié)核患者如果在2個月末時隨訪癥狀無明顯改善，則定義為不確定病例，不確定病例和未完成隨訪患者均排除分析。

7. 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 17.50軟件，采用卡方檢驗對不同檢測方法的檢測效能進行比較分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1. 基本情況：1378例肺結(jié)核可疑患者中，男923例(67.0%)，女455例(33.0%)；20歲以下患者58例(4.2%)，20～歲 499例(36.2%)，40～歲465例(33.8%)，60歲及以上患者356例(25.8%)。

2.診斷類型及隨訪情況：在1378例肺結(jié)核可疑患者中，1例無臨床信息。1377例納入患者中，涂陽肺結(jié)核168例，涂陰培陽肺結(jié)核257例，涂陰培陰臨床診斷肺結(jié)核355例，LAMP陰性排除肺結(jié)核患者585例，LAMP陽性排除肺結(jié)核患者12例。

對臨床診斷患者和LAMP陽性排除肺結(jié)核患者于2個月后進行隨訪。355例臨床診斷患者中，302例完成隨訪，隨訪完成率85.1%；12例LAMP陽性排除肺結(jié)核患者中，5例完成隨訪。總計60例患者未完成隨訪，9例為不配合，7例失去聯(lián)系，9例外出，5例住院，30例為其他原因。302例完成隨訪的臨床診斷患者中，293例被確診為臨床診斷病例，9例為不確定病例。5例LAMP陽性排除肺結(jié)核患者隨訪后均被確診為非結(jié)核病患者，見圖1。

3. 3種方法檢測效能評價：以臨床診斷結(jié)果為標準，對痰涂片、固體培養(yǎng)及PURE-LAMP檢測法進行檢測效能評價。在1377例有臨床信息患者中，排除60例未完成隨訪和9例不確定患者，共1308例患者的診斷結(jié)果可用于診斷效能評價，其中2例患者培養(yǎng)污染。痰涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測MTB的敏感度分別為23.40%(168/718)，58.91%(423/718)和49.44%(355/718)，PURE-LAMP檢測敏感度高于痰涂片鏡檢(χ2=185.02，P=0.000)，但低于固體培養(yǎng)試驗(χ2=46.24，P=0.000)，見表1。

圖1 研究對象納入與隨訪流程圖

檢測方法臨床診斷肺結(jié)核(例)非結(jié)核病(例)敏感度(95%CI值)特異度(95%CI值)陽性預測值(95%CI值)陰性預測值(95%CI值)痰涂片鏡檢法2340%(2030%～2650%)10000%(9930%～10000%)10000%(9730%～10000%)5175%(4885%～5466%) 陽性1680 陰性550590固體培養(yǎng)法5891%(5531%～6251%)10000%(9930%～10000%)10000%(9900%～10000%)6659%(6348%～6970%) 陽性4230 陰性295588PURE?LAMP4944%(4579%～5310%)9915%(9841%～9989%)9861%(9740%～9982%)6171%(5861%～6480%) 陽性3555 陰性363585

注 PURE-LAMP：快速核酸提取環(huán)介導等溫擴增檢測。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表2 以固體培養(yǎng)試驗結(jié)果為標準比較PURE-LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌效能

注 PURE-LAMP：快速核酸提取環(huán)介導等溫擴增檢測。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

4.固體培養(yǎng)試驗與PURE-LAMP法檢測效能的比較：在1378例納入患者中，排除1例培養(yǎng)污染、7例測序菌群鑒定失敗、41例非結(jié)核分枝桿菌感染以及6例測序鑒定后為非結(jié)核分枝桿菌感染的患者，共1323例患者可進行PURE-LAMP檢測效能分析，其中涂片陰性患者1158例。

在1323例納入患者中，以固體培養(yǎng)和測序菌群鑒定結(jié)果為標準，PURE-LAMP檢測MTB敏感度和特異度分別為90.24%(333/369)和96.86%(924/954)。在1158例涂片陰性患者中，PURE-LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為82.52%(170/206)和97.06%(924/952)，見表2。

討 論

本研究通過比較涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測診斷肺結(jié)核可疑癥狀者是否感染MTB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PURE-LAMP檢測操作簡單，實驗技術(shù)人員通過肉眼觀察熒光濁度進行結(jié)果判讀，簡單方便且未發(fā)現(xiàn)結(jié)果無法判讀標本。以臨床診斷結(jié)果為標準[9-10]，PURE-LAMP檢測MTB的敏感度明顯高于涂片鏡檢，低于固體培養(yǎng)試驗，同時低于之前研究報道的Xpert MTB/RIF檢測MTB的敏感度(58.82%)[10]。以固體培養(yǎng)試驗結(jié)果為標準，PURE-LAMP檢測敏感度和特異度分別為90.24%和96.86%，尤其是在涂陰患者中敏感度達到82.52%，檢測效能高于國內(nèi)外相關(guān)研究[5-6,11]。以上發(fā)現(xiàn)提示，PURE-LAMP檢測的臨床應用價值高于傳統(tǒng)涂片鏡檢，可更好地輔助臨床醫(yī)生對初診肺結(jié)核可疑癥狀者進行早期診斷和治療。

PURE-LAMP檢測與其他分子生物學檢測一樣都存在著一定的局限性，均不能得到活菌。由于MTB培養(yǎng)可得到活菌，因此，其在結(jié)核病細菌學檢查中仍占有不可替代的重要位置，但經(jīng)過短期藥物治療的患者感染細菌受到損傷會導致其在培養(yǎng)基上難以生長，同時，培養(yǎng)試驗陽性并不能排除NTM感染，需要繼續(xù)進行后續(xù)的菌種鑒定試驗。目前，我國大多數(shù)縣(區(qū))級結(jié)防機構(gòu)均不具備開展菌種鑒定試驗的能力，故培養(yǎng)試驗在進行初診肺結(jié)核可疑癥狀者的篩查方面也存在一定的局限性。

PURE-LAMP檢測操作簡單，所有反應只需在1個加熱裝置內(nèi)即可完成，封閉的反應裝置降低了污染發(fā)生的可能性。研究發(fā)現(xiàn)，5例LAMP陽性排除肺結(jié)核患者隨訪后均被確診為非結(jié)核病，提示初診PURE-LAMP檢測為假陽性。由于實驗室檢測的準確性對于患者的治療結(jié)果具有重要意義，特別是對于假陽性患者的鑒別對于減少患者個體損傷十分重要。因此，在分子生物學診斷技術(shù)的推廣應用過程中，臨床醫(yī)生在對就診患者進行診斷時，需要綜合實驗室、胸部X線攝片和臨床檢查結(jié)果，進行最終診斷，避免出現(xiàn)漏診或過診。

結(jié)核病患者的臨床表現(xiàn)差別很大。隨著社會經(jīng)濟條件的改善，因典型結(jié)核病臨床表現(xiàn)就診的患者越來越少，多數(shù)就診可疑患者痰標本量很少，使得實驗室和臨床醫(yī)生的診斷難度逐漸增大。PURE-LAMP檢測快速且敏感度高，可更好地輔助臨床醫(yī)生進行診斷，同時該方法具有操作簡單、所需痰標本量少(60 μl)以及對實驗室生物安全要求低等優(yōu)點，適合在實驗室工作條件較差的地區(qū)推廣使用?；诒敬卧u估結(jié)果提出如下應用建議：(1)由于PURE-LAMP檢測對實驗室硬件要求并不高，推薦在縣(區(qū))級實驗室使用PURE-LAMP檢測。但需要注意，PURE-LAMP檢測技術(shù)屬于分子生物學檢測技術(shù)，基層工作人員接觸較少，因此，對于接受完整培訓(約1周時間)的基層人員而言，需要1個月的試運行試驗以保證檢測結(jié)果的準確性。(2)PURE-LAMP檢測在每批實驗中需要完成陰性和陽性對照，從成本和對技術(shù)的熟練程度考慮，建議優(yōu)先在每日痰標本接收大于10份的實驗室中開展。

志謝 感謝比爾及梅琳達·蓋茨基金會對本項目的支持。感謝美國帕斯適宜衛(wèi)生科技組織(PATH)在項目設計、實施和數(shù)據(jù)分析過程中的協(xié)助。感謝河南省疾病預防控制中心、新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所和獲嘉縣疾病預防控制中心的實驗室和項目管理人員在項目實施過程中給予的支持和幫助！

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(本文編輯：李敬文)

Evaluation of rapid nucleic acid extraction loop-mediated isothermal amplification technology in the diagnosis of pulmonary tuberculosis

OUXi-chao,XIAHui,LIQiang,PANGYu,ZHAOBing,ZHANGZhi-ying,LIJun-chen,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,NationalCenterforTuberculosisControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

Correspondingauthor:ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the rapid nucleic acid extraction loop-mediated isothermal amplification technology (PURE-LAMP) in the diagnosis of pulmonary tuberculosis (TB). Methods A total of 1378 TB suspects were continuously recruited in Xinxiang tuberculosis dispensary and Huojia CDC from April 2102 to January 2013, three sputum specimens collecting from each patient were examined by smear, solid culture and PURE-LAMP. Then, compare sensitivities of smear, solid culture and PURE-LAMP based on the diagnosis and evaluate the sensitivity of PURE-LAMP according to solid culture result. Results Based on the diagnosis, the sensitivities of smear microscopy, solid culture and PURE-LAMP were 23.40% (168/718), 58.91% (423/718) and 49.44% (355/718), respectively. The sensitivity of PURE-LAMP was higher than that of smear (χ2=185.02,P=0.000), but lower than that of solid culture (χ2=46.24,P=0.000). Based on solid culture result, the sensitivity and specificity of PURE-LAMP were 90.24% (333/369) and 96.86% (924/954), respectively; while the sensitivity and specificity in smear negative patients were 82.52% (170/206) and 97.06% (924/952), respectively. Conclusion PURE-LAMP is easily operated, its sensitivity and specificity is relatively higher. It should be widely used in tuberculosis dispensary at county (district) level.

Mycobacteriumtuberculosis; Nucleic acid amplification technique; Diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.05.014

中國衛(wèi)計委與比爾及梅琳達·蓋茨基金會結(jié)核病防治項目(2009-04-01)

102206 北京，中國疾病預防控制中心結(jié)核病預防控制中心 國家結(jié)核病參比實驗室(歐喜超、夏輝、李強、逄宇、趙冰、趙雁林)；帕斯適宜衛(wèi)生科技組織(張治英、李俊晨)

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-02-01)