熒光定量PCR技術(shù)在診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中的價(jià)值

李元 雷國華 秦世炳

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·論著·

熒光定量PCR技術(shù)在診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中的價(jià)值

李元 雷國華 秦世炳

目的 探索熒光定量PCR技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者診斷中的價(jià)值。方法 選取2015年1月至2015年9月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院骨科進(jìn)行手術(shù)治療的39例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(病例組)和20例非骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者(對照組)作為研究對象。收集研究對象的石蠟包埋組織標(biāo)本，并對標(biāo)本行結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測，計(jì)算熒光定量PCR檢測的敏感度及特異度。通過病歷查詢研究對象的組織形態(tài)學(xué)及抗酸染色檢測結(jié)果。比較熒光定量PCR技術(shù)與組織形態(tài)學(xué)及抗酸染色檢測敏感度的差異。結(jié)果 病例組39例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，熒光定量PCR檢測的敏感度為97.4%(38/39)；病例組中8例組織形態(tài)學(xué)不能確診的患者中，熒光定量PCR檢測出7例陽性；對照組20例非骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，熒光定量PCR檢測的特異度為100.0%(20/20)。病例組中，組織形態(tài)學(xué)檢測的敏感度為79.5%(31/39)，抗酸染色檢測的敏感度為48.7%(19/39)，均低于熒光定量PCR檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.39，P=0.000)，熒光定量PCR檢測敏感度高于組織形態(tài)學(xué)檢測和抗酸染色檢測(熒光定量PCR與組織形態(tài)學(xué)比較，χ2=4.52，P=0.033；熒光定量PCR與抗酸染色比較，χ2=23.52，P=0.000)。對照組中，組織形態(tài)學(xué)檢測的特異度為100.0%(20/20)，抗酸染色檢測的特異度為100.0%(20/20)，與熒光定量PCR檢測的特異度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.00，P=1.000)。 結(jié)論 熒光定量PCR技術(shù)較組織形態(tài)學(xué)及抗酸染色技術(shù)具有更高的敏感度，有助于骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷。

結(jié)核，骨關(guān)節(jié)； 熒光定量PCR； 診斷

骨關(guān)節(jié)結(jié)核為肺外結(jié)核，約占全部結(jié)核病患者的1%～3%[1]。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)一直被認(rèn)為是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶以組織標(biāo)本為主，不適宜培養(yǎng)；同時(shí)，骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本培養(yǎng)陽性率低、耗時(shí)長[2-3]。因此，臨床上骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷一直以病理學(xué)檢查結(jié)果為診斷依據(jù)[4]。

傳統(tǒng)病理學(xué)診斷主要依靠組織形態(tài)學(xué)及抗酸染色，因?yàn)橛胁坏湫腿庋磕[性炎及非結(jié)核分枝桿菌的存在，因此不可避免的造成漏診或誤診[5-7]。如何提高診斷的敏感度及特異度，降低漏診與誤診的風(fēng)險(xiǎn)就成為臨床上需要解決的問題。以熒光定量PCR技術(shù)為核心的分子病理學(xué)的出現(xiàn)為解決這一問題提供了契機(jī)。本研究使用石蠟包埋組織標(biāo)本行結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測，探索熒光定量PCR技術(shù)在診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中的價(jià)值。

對象和方法

1.對象：選取2015年1月至2015年9月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院骨科進(jìn)行手術(shù)治療的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者作為病例組，共39例。39例患者術(shù)中膿液標(biāo)本經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)或快速培養(yǎng)(BACTEC 960)證實(shí)有結(jié)核分枝桿菌生長，即細(xì)菌學(xué)證實(shí)為骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者。其中，關(guān)節(jié)結(jié)核15例，脊柱結(jié)核24例；男21例，女18例；年齡18～65歲，中位年齡為47.0歲。選取同期在本科室進(jìn)行手術(shù)治療的非骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者作為對照組，共20例。其中，骨腫瘤8例，骨關(guān)節(jié)化膿性感染12例；男11例，女9例；年齡21～69歲，中位年齡為50.5歲。分別收集上述兩組患者的石蠟包埋組織標(biāo)本。通過查閱病歷獲得病例組和對照組患者的組織形態(tài)學(xué)結(jié)果及石蠟包埋組織標(biāo)本的抗酸染色結(jié)果。本研究已通過本院倫理委員會(huì)審核，所有研究對象均簽署知情同意書。

2.試劑和儀器：石蠟包埋組織DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(型號(hào)Z-RD-0060-01)購自上海之江生物科技股份有限公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)Cobas Z 480)購自瑞士羅氏公司。

3.DNA提?。菏炃衅? μm，根據(jù)組織大小取5～10片，放入1.5 ml離心管中，12 000 r/min，離心半徑15 cm，離心10 min。按照試劑盒操作說明書提取DNA。

4.熒光定量PCR：按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為40 μl。反應(yīng)條件為：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min；93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；于60 ℃進(jìn)行熒光檢測。Taqman熒光探針為6-FAM(6-羧基熒光素)標(biāo)記。每批檢測均設(shè)置陰性及陽性對照。檢測結(jié)果判定：Ct(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))≤38為陽性；Ct=40或無擴(kuò)增曲線為陰性；Ct 值介于38～40則重新檢測，若重新測定Ct值依然在38～40之間，同時(shí)擴(kuò)增曲線呈S形則判定為陽性，若為非典型曲線則判定為陰性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 17.0軟件，以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熒光定量PCR技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的敏感度及特異度，三種檢測方法敏感度和特異度的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.熒光定量PCR檢測：病例組中，38例熒光定量PCR檢測陽性，1例患者檢測陰性；熒光定量PCR檢測的敏感度為97.4%(38/39)。對照組中20例患者熒光定量PCR檢測均為陰性，熒光定量PCR的特異度為100.0%(20/20)。

2.組織形態(tài)學(xué)檢測：病例組39例患者的術(shù)后組織形態(tài)學(xué)結(jié)果：31例患者的組織形態(tài)學(xué)確診為結(jié)核；8例患者不能確診，包括4例患者檢測結(jié)果為可疑結(jié)核，4例患者檢測結(jié)果為慢性肉芽腫性炎，需要進(jìn)一步鑒別診斷。組織形態(tài)學(xué)檢測的敏感度為79.5%(31/39)。對照組20例患者的組織形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果均除外結(jié)核，檢測的特異度為100.0%(20/20)。

3.抗酸染色結(jié)果：病例組抗酸染色結(jié)果為：19例患者抗酸染色陽性，20例患者抗酸染色陰性，抗酸染色的敏感度為48.7%(19/39)。對照組20例患者的抗酸染色結(jié)果均為陰性，抗酸染色的特異度為100.0%(20/20)。

4.三種方法檢測效果的比較：三種檢測方法的敏感度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.39，P=0.000)，熒光定量PCR檢測敏感度高于組織形態(tài)學(xué)檢測和抗酸染色檢測(熒光定量PCR與組織形態(tài)學(xué)比較，χ2=4.52，P=0.033；熒光定量PCR與抗酸染色比較，χ2=23.52，P=0.000)。比較三種檢測方法的特異度，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.00，P=1.000)。

病例組中，經(jīng)組織形態(tài)學(xué)檢測8例患者不能確診，應(yīng)用抗酸染色法檢測均為陰性；應(yīng)用熒光定量PCR檢測結(jié)果7例為陽性(表1)。

表1 病例組中8例組織形態(tài)學(xué)不能確診患者的熒光定量PCR及抗酸染色結(jié)果

討 論

目前，骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的診斷主要依靠病理診斷。傳統(tǒng)病理學(xué)診斷方法主要包括組織形態(tài)學(xué)及病原學(xué)，即通過大體和鏡下直接觀察病灶組織的病理形態(tài)學(xué)變化，及利用抗酸染色查找病原菌來獲得診斷，具有針對性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)[4]。

組織形態(tài)學(xué)診斷要求病變組織具備典型的結(jié)核肉芽腫樣改變(包括類上皮細(xì)胞、朗漢斯巨細(xì)胞、干酪性壞死等)才能作出診斷[4]。本研究中組織形態(tài)學(xué)技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的敏感度為79.4%。但結(jié)核病變可以表現(xiàn)為不典型肉芽腫，同時(shí)，非結(jié)核病變也可表現(xiàn)為類似于結(jié)核的肉芽腫，臨床上不可避免造成漏診或誤診[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)有8例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者通過組織形態(tài)學(xué)不能確診，有漏診的風(fēng)險(xiǎn)。因此，當(dāng)組織形態(tài)學(xué)診斷在遇到不典型肉芽腫性病變時(shí)無法作出診斷。

骨關(guān)節(jié)結(jié)核為感染性病變，病原菌為結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌為抗酸桿菌。若在病理標(biāo)本中找到抗酸桿菌就基本可以診斷為結(jié)核病。因?yàn)榭顾崛旧夹g(shù)簡單、易行、廉價(jià)、快速，所以抗酸染色伴隨結(jié)核病的診斷一直應(yīng)用至今。但由于骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶含菌量少，加之抗酸染色技術(shù)的敏感度低，使其臨床應(yīng)用也受到一定限制[8-9]。本研究中抗酸染色技術(shù)診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的敏感度為48.7%，有51.3%的患者有漏診的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)抗酸染色不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌，有誤診的風(fēng)險(xiǎn)[10]。

PCR技術(shù)自1985年問世以來得到快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用，但一度曾因污染及假陽性等問題使其結(jié)果受到質(zhì)疑。熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記的探針，把核酸擴(kuò)增、雜交及光譜檢測技術(shù)結(jié)合在一起。熒光定量PCR是在一個(gè)相對封閉的系統(tǒng)中完成，避免了污染降低了假陽性率，同時(shí)熒光探針的使用提高了檢測的敏感度及特異度[11]。

研究證實(shí)，使用石蠟包埋組織標(biāo)本行結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測具有可行性及可靠性[12-13]。與羅氏培養(yǎng)相比，熒光定量PCR技術(shù)可以有效提高利用組織標(biāo)本診斷結(jié)核病的陽性率[14-15]。本研究中，應(yīng)用石蠟包埋組織標(biāo)本行熒光定量PCR檢測對骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者診斷的敏感度為97.4%。當(dāng)面對組織形態(tài)學(xué)及病原學(xué)都無法診斷的不典型患者時(shí)，這就需要熒光定量PCR技術(shù)來進(jìn)行鑒別診斷，這是熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)勢所在。本研究顯示，熒光定量PCR檢測的敏感度高于組織形態(tài)學(xué)及抗酸染色技術(shù)，這說明熒光定量PCR技術(shù)可以提高結(jié)核病診斷的敏感度，降低漏診率。同時(shí)通過檢測分枝桿菌特異的基因片段，分子病理學(xué)還可以鑒別傳統(tǒng)病理學(xué)不能鑒別的結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌[16]。以上情況說明，熒光定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)組織形態(tài)學(xué)及抗酸染色技術(shù)相比具明顯優(yōu)勢。熒光定量PCR技術(shù)在提高骨關(guān)節(jié)結(jié)核病患者診斷率的同時(shí)，明確診斷后患者就可以得到及時(shí)治療，可以挽救患者保留更多的關(guān)節(jié)功能。

雖然熒光定量PCR技術(shù)靈敏、快速、特異，但也有假陽性的存在，因此，骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的診斷不能單獨(dú)依賴熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)結(jié)果及臨床信息[17-18]。另外，由于本研究納入患者數(shù)較少，使結(jié)果的代表性受到限制，并可能造成檢測結(jié)果特異度高。若不計(jì)成本因素，對每一份可疑骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的病理組織標(biāo)本同時(shí)行傳統(tǒng)病理學(xué)檢測及熒光定量PCR檢測，將2種檢測方法并聯(lián)使用則可提高敏感度，串聯(lián)使用則可以提高特異度。

綜上所述，本研究顯示在骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的組織標(biāo)本檢測中熒光定量PCR的敏感度最高，組織形態(tài)病理學(xué)居中，抗酸染色最低。在實(shí)際臨床使用中將熒光定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)病理學(xué)結(jié)合使用可降低漏診及誤診的風(fēng)險(xiǎn)。

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(本文編輯：王然 李敬文)

Evaluation the clinical value of fluorescent quantitative PCR technique in diagnosis of osteoarticular tuberculosis

LIYuan，LEIGuo-hua,QINShi-bing.

DepartmentofOrthopedics,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

QINShi-bing,Email：qinsb@sina.com

Objective To evaluate the clinical value of fluorescent quantitative PCR technique in diagnosis of osteoarticular tuberculosis. Methods During Jan 2015 to Sep 2015, 39 osteoarticular tuberculosis patients (case group) and 20 patients in other osteoarticular diseases (control group) were enrolled as research subjects from department of orthopedics, Beijing Chest Hospital, and all the patients received operation. Paraffin-embedded tissues samples were collected from all the enrolled subjects. All specimens were performed by fluorescent quantitative PCR. Sensitivity and specificity were calculated for fluorescent quantitative PCR. Histomorphology and acid fast stain results were extracted from checking records. The difference in sensitivity were compared among fluorescent quantitative PCR, histomorphology, and acid fast stain. Results Among the 39 osteoarticular tuberculosis specimens in case gruop，the sensitivity of fluorescent quantitative PCR was 97.4% (38/39), and 7 patients out of the 8 samples with negative histomorphology results were positive by fluorescent quantitative PCR test. For the control group，the specificity of fluorescent quantitative PCR was 100% (20/20). In case group, the sensitivity of histomorphology and acid fast stain was 79.5% (31/39),48.7% (19/39),respectively.As for the sensitivity, fluorescent quantitative PCR was superior to histomorphology and acid fast stain. The sensitivity in diagnosis of osteoarticular tuberculosis was statistical difference among fluorescent quantitative PCR, histomorphology and acid fast stain (χ2=25.39，P=0.000).In control group，the specificity of histomorphology and acid fast stain was all 100% (20/20).There was no statistical difference in specificity among specificity fluorescent quantitative PCR, histomorphology and acid fast stain (χ2=0.00，P=1.000). Conclusion Comparing to histomorphology and acid fast stain, fluorescent quantitative PCR has higher sensitivity. Therefore, the higher sensitivity of fluorescent quantitative PCR has the potential to improve the diagnosis of osteoarticular tuberculosis.

Tuberculosis，osteoarticular； Fluorescent quantitative PCR； Diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.006

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院骨科

秦世炳，Email：qinsb@sina.com

2015-10-08)