閉合蛋白Occludin在畜禽腸道屏障中的調(diào)節(jié)作用

方成堃+何邵平+賀建華

摘要：腸道是動(dòng)物消化食物、吸收營(yíng)養(yǎng)的主要場(chǎng)所。閉合蛋白Occludin作為細(xì)胞緊密連接的重要組成部分，發(fā)揮封閉細(xì)胞間隙、形成機(jī)體滲透屏障、保持細(xì)胞兩側(cè)物質(zhì)差異的作用。本文綜述了閉合蛋白Occludin在調(diào)控畜禽腸道健康中的作用及影響其蛋白表達(dá)的一些因素。

關(guān)鍵詞：閉合蛋白；腸道健康；調(diào)控作用

小腸是動(dòng)物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所。但是，由于各種外界因素的應(yīng)激，使得動(dòng)物常常出現(xiàn)食欲差、消化功能紊亂等問(wèn)題，從而導(dǎo)致腸道屏障受損，腸絨毛萎縮，隱窩深度加大，進(jìn)而出現(xiàn)腹瀉和生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象。作為上皮細(xì)胞間連接的一種主要形式，緊密連接（Tight Junction）對(duì)維護(hù)上皮細(xì)胞兩側(cè)物質(zhì)的差異和保持細(xì)胞極性起著重要的作用。緊密連接是由一系列跨膜蛋白和外周蛋白相互作用而形成的一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系，能被多種方式所調(diào)控。閉合蛋白是其中最重要的蛋白質(zhì)分子之一，上皮細(xì)胞通過(guò)Occludin蛋白封閉細(xì)胞間隙，并與ZO-1等結(jié)合形成緊密連接的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。Occludin蛋白功能狀態(tài)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，有著重要的臨床意義。

1閉合蛋白Occludin的結(jié)構(gòu)

閉合蛋白（Occludin）最早是由Furuse等發(fā)現(xiàn)的，其定位于雞肝緊密連接的膜內(nèi)在蛋白，由504個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量是64×103，另有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。氨基端和羧基端均位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)，2個(gè)富含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的細(xì)胞外環(huán)，一個(gè)由10個(gè)氨基酸殘基組成的細(xì)胞內(nèi)環(huán)。在N-端，氨基截短的閉合蛋白Occludin可精確地結(jié)合到緊密連接上，并能與ZO-1相結(jié)合，但熒光示蹤劑的通透性上升，無(wú)法維持較高的跨細(xì)胞電阻。研究表明，N-末端縮短的閉合蛋白Occludin位于小鼠上皮細(xì)胞系CSG120/7上。通過(guò)電生理學(xué)測(cè)定結(jié)果表明，N-末端縮短結(jié)構(gòu)將對(duì)緊密連接的屏障功能產(chǎn)生不利影響。另有研究表明，在轉(zhuǎn)染的狗的腎臟細(xì)胞中，C-末端縮短的閉合蛋白Occludin能夠精確定位在緊密連接上。C-端截短的雞閉合蛋白Occludin可被整合至緊密連接中，但會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間通透性的增加，導(dǎo)入正常的閉合蛋白Occludin的mRNA可糾正，在羧基段含有一個(gè)疏水（coiled-coil）結(jié)構(gòu)域。這個(gè)結(jié)構(gòu)域是與ZO-1的氨基端結(jié)合的位點(diǎn)，ZO-1的羧基段結(jié)構(gòu)域再與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白結(jié)合。Coiled-coil結(jié)構(gòu)域也是磷脂酰肌醇-3（PI-3）激酶等調(diào)節(jié)蛋白作用的位點(diǎn)。

2閉合蛋白Occludin的功能

閉合蛋白Occludin的最主要功能是參與維持緊密連接的屏障功能，對(duì)Raf1介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生有強(qiáng)烈的抑制作用。比如，在犬腎細(xì)胞系（MDCK）中過(guò)量表達(dá)的閉合蛋白Occludin會(huì)提高經(jīng)上皮細(xì)胞的跨膜電阻，并且用合成肽模擬細(xì)胞外的閉合蛋白Occludin的循環(huán)結(jié)構(gòu)被指出會(huì)其使正常的回路斷裂從而使上皮細(xì)胞的通透新增加。在滅活鼠中試驗(yàn)中，研究者指出緊密連接具有復(fù)雜的表觀組織學(xué)特征，即使上皮組織中有慢性炎癥反應(yīng)，但是緊密連接在形態(tài)學(xué)上是完整的，意味著在緊密連接中閉合蛋白Occludin有可能更多的是擔(dān)任一個(gè)維持其穩(wěn)定性和屏障功能的角色。同時(shí)指出，在皮層肌動(dòng)蛋白組織和不同的內(nèi)皮細(xì)胞模型的屏障功能中閉合蛋白Occludin是必不可少的。通過(guò)閉合蛋白Occludin可下調(diào)蛋白水解和透性化因素處理的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和磷脂酶，從而提高內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。

3閉合蛋白Occludin與畜禽腸道營(yíng)養(yǎng)調(diào)控

3.1抗?fàn)I養(yǎng)因子與閉合蛋白Occludin

大豆凝集素（SBA）是大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子中重要的一種，影響動(dòng)物的腸道結(jié)構(gòu)和功能，從而降低了動(dòng)物對(duì)大豆蛋白的利用效率。SBA會(huì)顯著性降低細(xì)胞間緊密連接occludin和claudin-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量，降低腸道的機(jī)械屏障功能。另一研究表明：隨大豆球蛋白濃度逐漸升高，仔豬小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Z0～1和閉合蛋白Occludin mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。

3.2斷奶應(yīng)對(duì)閉合蛋白Occludin 表達(dá)的影響

仔豬早期斷奶應(yīng)激會(huì)引起小腸絨毛高度下降，隱窩深度加深，對(duì)斷奶仔豬小腸形態(tài)造成損傷。仔豬早期斷奶后腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白閉合蛋白Occludin mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降，至35日齡時(shí)雖有所恢復(fù)，但仍然低于斷奶前表達(dá)水平。閉合蛋白Occludin一旦進(jìn)入緊密連接，其連接部位的膜通透性降低，僅允許小分子出入，而大分子難以進(jìn)出。它的存在決定腸道選擇性屏障，一旦發(fā)生變異、減少和缺失可以引起腸上皮細(xì)胞間隙通透性增加，細(xì)菌內(nèi)毒素等大分子物質(zhì)可透過(guò)緊密連接進(jìn)入體循環(huán)。早期斷奶后仔豬腸道的通透性增加，腸屏障功能破壞，可能歸因于腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白閉合蛋白Occludin mRNA表達(dá)下降。

3.3針對(duì)閉合蛋白Occludin的影響

在維持動(dòng)物胃腸道上皮屏障的功能完整性上，鋅的作用已被廣泛報(bào)道，由于鋅的缺乏會(huì)導(dǎo)致緊密連接的改變，其對(duì)閉合蛋白Occludin也有一定的影響。高劑量氧化鋅對(duì)腸屏障的保護(hù)作用并不是通過(guò)改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，而是通過(guò)抑制細(xì)菌在腸道黏膜的黏附，阻止上皮細(xì)胞滲透性的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)的。以產(chǎn)腸毒素型埃希氏大腸桿菌（ETEC，K88）所導(dǎo)致的受損Caco-2細(xì)胞系作為模型，研究氧化鋅對(duì)受損細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，高劑量氧化鋅增加了培養(yǎng)細(xì)胞系的細(xì)胞緊密連接滲透性，氧化鋅可以阻止黏膜完整性遭到破壞。胡彩虹等的研究表明，高鋅可以調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白閉合蛋白Occludin和ZO-l的表達(dá)，同時(shí)指出高鋅影響閉合蛋白Occludin和ZO-l基因表達(dá)的作用是通過(guò)維護(hù)腸黏膜功能，減少細(xì)菌和內(nèi)毒素通透和其對(duì)某些細(xì)胞因子的調(diào)控產(chǎn)生作用實(shí)現(xiàn)的。

3.4微生態(tài)劑對(duì)閉合蛋白Occludin的影響

目前認(rèn)為腸道致病菌影響緊密連接功能的途徑：（1）改變宿主細(xì)胞緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)及功能；（2）破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)；（3）影響其他細(xì)胞信號(hào)通路，如PKC途徑等。姜偉煒等的研究顯示，大腸桿菌黏附于腸道上皮細(xì)胞后，可分泌效應(yīng)分子，并通過(guò)各種途徑作用于細(xì)胞，引起腸黏膜功能紊亂，如電解質(zhì)分泌紊亂，緊密連接屏障被破壞，細(xì)菌異位感染等，或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在陳德龍等的試驗(yàn)結(jié)果中表明，在LAB1模擬治療S.cho和E.coli感染的試驗(yàn)中，閉合蛋白Occludin的表達(dá)量與LAB1濃度有很強(qiáng)的正濃度效應(yīng)，和S.cho與E.coli感染量呈負(fù)濃度效應(yīng)。同時(shí)，Shin等的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道致病性大腸桿菌可使閉合蛋白Occludin去磷酸化，導(dǎo)致閉合蛋白Occludin位置改變，跨膜電阻值降低。

抗菌肽，又稱微生物肽，是一類具有抗菌、抗病毒活性的小分子多肽。在豬的空腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入抗菌肽培養(yǎng)24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)含5.0ug/mL以上的抗菌肽的培養(yǎng)基中，閉合蛋白Occludin基因相對(duì)表達(dá)量有上升趨勢(shì)。有研究表明腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的基因表達(dá)與腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物（如磷壁酸、丁酸等）有關(guān)。因此，抗菌肽可維持腸道微生態(tài)平衡，提高腸粘膜免疫力，間接促進(jìn)閉合但的基因表達(dá)。

3.5谷氨酰胺對(duì)閉合蛋白Occludin的影響

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是胃腸道管腔細(xì)胞的基本能量來(lái)源，是腸道粘膜細(xì)胞代謝必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)維持腸道粘膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性起著十分重要的作用。已有研究報(bào)道在腸細(xì)胞培養(yǎng)液中抑制谷氨酰胺合酶活性或不添加谷氨酰胺時(shí)，甘露醇滲透性增加，跨上皮電阻抗值下降，從而減少閉合蛋白Occludin表達(dá)并擾亂其分布，引起腸道屏障功能的損傷。近年研究表明，信號(hào)通路ERK和NF-κB與調(diào)控閉合蛋白修復(fù)腸道屏障損傷有關(guān)。

4小結(jié)

黏膜屏障是腸道重要的屏障之一，其由上皮細(xì)胞以及細(xì)胞間的眾多連接所構(gòu)成如緊密連接、縫隙連接（gapjunction，GJ）、點(diǎn)附連接（adherencejunction，AJ）以及橋粒（desmosome）等。緊密連接主要位于細(xì)胞頂端表面，是上皮細(xì)胞間連接最為重要的結(jié)構(gòu)復(fù)合物，在維持腸粘膜的屏障功能方面發(fā)揮重要的作用，閉合蛋白Occludin對(duì)維持上皮細(xì)胞極性，形成機(jī)體滲透屏障具有重要的作用。雖然關(guān)于閉合蛋白結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了部分的研究，但是從營(yíng)養(yǎng)的角度，研究食物或飼料中某種物質(zhì)對(duì)機(jī)體閉合蛋白結(jié)構(gòu)和表達(dá)等方面的影響可以為深入揭示閉合蛋白功能提供數(shù)據(jù)支持，并且從生理、病例變化中研究其結(jié)構(gòu)的改變，為研究閉合蛋白Occludin在調(diào)控動(dòng)物腸道營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用提供重要的理論基礎(chǔ)。