從補陽還五緩釋片體外釋放特征窺中藥制劑超分子印跡模板お

楊巖濤 吳春英 劉文龍 石繼連 周晉 賀福元

[摘要]該研究考察了自制補陽還五單室滲透泵緩釋片的體外釋放情況，采用總量統(tǒng)計矩原理對其段帶相似度進行計算，并對其體外釋放特征進行分析以探討中藥制劑超分子印跡模板的存在。結(jié)果表明，中藥中不同結(jié)構(gòu)的多成分可能存在共同的印跡模板，滲透泵原理制備的補陽還五緩釋片中多數(shù)成分能夠達到“整體受控、同步釋放”的目的，但應(yīng)進一步探討中藥復(fù)方中的超分子印跡模板，嘗試通過印跡模板控制不同成分的整體同步釋放，尋求更適合于中藥多成分的控緩釋制劑制備技術(shù)，使之符合中藥用藥特點。

[關(guān)鍵詞]補陽還五；超分子；印跡模板；緩釋；整體受控

前期作者制備了補陽還五緩釋片，以滲透泵原理控制中藥多成分整體釋放[1]，證實了口服滲透泵片制劑以其獨特的釋藥方式和平穩(wěn)的釋藥速度成為了控緩釋制劑的有效形式。然而對于多種成分的釋藥過程，尤其是對于復(fù)雜的中藥復(fù)方控緩釋制劑而言，滲透泵片制劑亦難以完全滿足契合中藥多成分控緩釋制劑要求的“整體受控，同步釋藥”的要求。而在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，人體與中藥均為復(fù)雜的生物超分子體系[2]，具有與人體分子通道結(jié)構(gòu)相同“印跡模板”的中藥分子應(yīng)是構(gòu)成中藥有效成分的主體，中藥有效成分與經(jīng)絡(luò)臟腑的印跡作用便形成了中藥的藥性理論與功效[3]。根據(jù)此猜想，在控緩釋制劑中，具有相同分子印跡模板的藥物成分釋放行為應(yīng)較為接近，亦可根據(jù)“印跡模板”的相關(guān)理論和技術(shù)來實現(xiàn)對中藥多成分的整體控制釋放，以印跡模板控制藥物釋放，避免外界因素帶來的影響，實現(xiàn)中藥緩控釋制劑各有效成分整體受控、按一定的構(gòu)成比同步釋放，符合中藥用藥的特點。

補陽還五湯為中醫(yī)經(jīng)典名方，首載于清代王清任《醫(yī)林改錯》，由黃芪、當(dāng)歸、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，具補氣、通絡(luò)之功，其在抗血栓、抗衰老、抗腦栓血、抗血脂及調(diào)節(jié)免疫功能方面有預(yù)防和治療的作用。該方療效確切，有一定安全性，胃腸道有較好吸收，其適用患者多服藥困難，適宜制成控緩釋制劑，并且該方成分復(fù)雜，對中藥復(fù)方具有顯著的代表性，筆者前期亦自制了補陽還五滲透泵緩釋片，并對其體外釋放行為進行了研究[1]，得出了采用滲透泵緩釋制劑原理制備的補陽還五緩釋片多成分溶出能基本達到“整體受控、同步釋放”的目的，但前述研究僅僅是建立在宏觀釋放情況相似度的計算結(jié)果上的，表述未盡全面，因此嘗試采用段帶總量統(tǒng)計矩相似度的方法對之進行分析，期望以制劑中成分釋放特征來窺探中藥制劑超分子印跡模板規(guī)律，以期尋找以“印跡模板”受控理論來實現(xiàn)不同成分而同“印跡模板”的控制釋放過程，為中藥復(fù)方控緩釋制劑的研究提供支撐。

1基本原理

11超分子印跡模板理論

超分子印跡模板的概念來源于Fischer的酶與底物作用的“鎖與鑰匙模型”以及Pauling提出的抗體形成學(xué)說，類似于藥理學(xué)經(jīng)典的受體配體理論，可以用來解釋受體配體理論。但二者又有不同，印跡模板是指以某一特定的目標分子為模板，尋找制備對該分子有特異選擇性聚合物的過程，屬于超分子化學(xué)范疇，同樣具有自組織、自組裝、自識別與自復(fù)制的特點[45]。超分子“印跡模板”概念是化學(xué)上的分子結(jié)構(gòu)概念，是“在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點上能完全匹配的模板物”，對中藥成分來說既是其分子結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)，也可以說是活性原子團的空間排列點陣，能從化學(xué)物質(zhì)的本源上說明主客體分子（在一定程度下是受體配體理論）的普遍作用規(guī)律。目前已有將印跡模板技術(shù)用于藥物分離過程，因此如能根據(jù)藥物成分的釋放行為尋找到不同藥物成分的共同印跡模板，探索在中藥復(fù)方中具有相同印跡模板的成分群，嘗試采用超分子印跡模板理論指導(dǎo)中藥復(fù)方控緩釋制劑的制備，實現(xiàn)多成分“整體受控”的目標。

12段帶總量統(tǒng)計矩相似度理論

將統(tǒng)計矩原理用于色譜學(xué)分析，建立了總量統(tǒng)計矩分析法，可獲得中藥指紋圖譜的總量零階矩（AUC）、總量一階矩（MCRT）、總量二階矩（VCRT）及總響應(yīng)率（AUCPW）等一系列總量統(tǒng)計矩參數(shù)。結(jié)合總量統(tǒng)計矩的加和性[6]，可將整張指紋圖譜按照一定的方式進行段帶，計算出每一段帶的總量統(tǒng)計矩參數(shù)，可反映出在某一段出峰時間內(nèi)的成分指紋圖譜信息，再將2個指紋圖譜相應(yīng)段帶的總量統(tǒng)計矩參數(shù)轉(zhuǎn)變成2個正態(tài)分布曲線，并定義相似度為2個指紋圖譜的正態(tài)曲線下重疊面積之和[7]。

總量統(tǒng)計矩相似度法先將指紋圖譜曲線函數(shù)整合為正態(tài)分布函數(shù)，再對之進行相似度計算，其值為0～1，體現(xiàn)了單成分特征峰與指紋圖譜的隨機性，又體現(xiàn)了經(jīng)總量統(tǒng)計矩整合后的整體性，是指紋圖譜特征性與模糊性的統(tǒng)一，且具有加合性與偶聯(lián)性。

2材料與方法

21材料

Waters公司的高效液相色譜儀，Breeze工作站，Waters 2487 Dual Absorbance Detector，ZRS6智能溶出儀（天津大學(xué)無線電廠）， BY300小型包衣機（上海黃海藥檢儀器廠），重型單沖壓片機（上海遠東制藥機械總廠），乙腈為進口色譜純，蒸餾水為二次重蒸餾水，醋酸纖維素、聚乙二醇、乙醇等其他試劑均為分析純。

補陽還五湯復(fù)方藥材——黃芪、當(dāng)歸、川芎、紅花、赤芍、桃仁及地龍均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus （Fisch） Bge var monghokicus （Bge） Hsiao 干燥根，傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis （Oliv） Diels的干燥根，傘形科植物川芎Iigusticum chuanxiong Hort的干燥根，菊科植物紅花Carthamus tinctorius L的干燥花，毛莨科植物芍藥Paeonia lactlora Pall的干燥根莖，薔薇科植物桃Prunus persica （L）Batsch的干燥成熟種子，環(huán)節(jié)動物門鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum （E perrier）的干燥主體。處方：黃芪60 g，當(dāng)歸9 g，川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，紅花9 g，地龍9 g。

22色譜條件

Ultimate XBC18柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈（A）水（含1%乙酸，B），梯度洗脫（0～10 min，0% A；10～25 min，7% A；25～35 min，125% A；35～45 min，18% A；45～55 min，25% A；55～65 min，30% A；65～70 min，325% A；70～71 min，37% A；71～80 min，40% A；80～100 min，80% A；100～115 min，100% A；115～120 min，0% A），流速1 mL·min-1，UV 檢測264 nm，柱溫40 ℃。

23補陽還五緩釋片及待測樣品的制備

補陽還五緩釋片的制備：取補陽還五湯原方，加8倍量水煎煮l h，共2次，合并煎煮液并將之濃縮至約1∶1，加乙醇醇沉2次，每次靜置24 h，過濾。濾液回收乙醇至凈，濃縮至流浸膏，加入適量淀粉和糊精，混勻，60 ℃通風(fēng)干燥至全干，取出粉碎制得補陽還五全方藥粉，備用。

取已制備補陽還五湯全方藥粉，加入適量微晶纖維素，以及適量氯化鈉作為促滲劑，噴灑適量95%乙醇，10 目篩制粒，置于干燥箱內(nèi)于60 ℃通風(fēng)干燥15 h后，用14目篩整粒，使細粉含量不超過20%，壓片。

配制約30 g·L-1的醋酸纖維素丙酮溶液，加入適量PEG6000作為致孔劑，取已壓制片芯，噴霧包衣，在已包衣的片劑兩側(cè)分別打孔，制得補陽還五滲透泵緩釋片。

待測樣品溶液的制備：取補陽還五緩釋片，照釋放度測定法（《中國藥典》2005年版二部附錄XD第一法），采用溶出度測定法（《中國藥典》2010年版二部附錄XC）第三法裝置，以01 mol·L-1的鹽酸溶液250 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，溫度370 ℃，依法操作并分別在1，3，5，7，9 h時取樣，每次取樣5 mL，同時補充等溫等體積的溶出介質(zhì)，所取樣品于60 ℃真空干燥，揮干溶劑，加05 mL甲醇溶解，過045 μm微孔濾膜即得待測樣品。

3結(jié)果與分析

31補陽還五滲透泵緩釋片體外溶出指紋圖譜的建立及其積分條件的確定

311指紋圖譜積分條件的確定精密吸取甲醇溶液5 μL，進樣測得空白圖譜，以儀器最小的積分門檻值進行積分得空白甲醇參數(shù)，再考慮進行梯度洗脫時，洗脫劑的比例改變及甲醇雜志產(chǎn)生的穩(wěn)定的空白對照峰，提高最小峰面積再次進行積分，根據(jù)噪音峰的平均峰寬、平均響應(yīng)率、平均最小峰面積、平均最小峰高以及信噪比為3倍[8]，結(jié)合總量統(tǒng)計矩加合原理[6]確定該指紋圖譜的積分閾值：峰寬、響應(yīng)率、面積總量和峰高分別為26 s，45 V·s-1，360 μV·s，20 μV。

312補陽還五滲透泵緩釋片體外溶出指紋圖譜取自制補陽還五緩釋片按23項下釋放度測定方法進行釋放度測定分別制得釋放1，3，5，7，9 h樣品，按22項下方法各取樣5 μL進樣制備指紋圖譜S2～S6，空白甲醇樣品指紋圖譜S1，見圖1。

32補陽還五緩釋片釋放特征分析

分別對指紋圖譜S2～S6按前述積分條件積分，積分后輸出數(shù)據(jù)，見表1。

對表1數(shù)據(jù)進行分段，按10 min為段采用總量統(tǒng)計矩相似度法分別計算釋放時間1，3，5，7 h與釋放9 h的指紋圖譜即S6之間的相似度，共計11段，其相似度結(jié)果見表2。

由相似度可以看出，在補陽還五滲透泵緩釋片中復(fù)方補陽還五藥物中大多數(shù)成分能實現(xiàn)整體受控，隨著釋放時間的延長，指紋圖譜相似度逐漸逼近，但也可看出，在指紋圖譜不同出峰時間即不同成分的釋藥階段并不完全雷同，出峰時間除20～30，30～40，70～80 min 3段外，其余各段7 h與9 h相似度均接近于1，說明這些成分在7 h內(nèi)即基本釋放完畢，而出峰時間在這3段的成分則在7～9 h仍有釋放；出峰時間在50～60 min的成分在1 h內(nèi)有快速釋放，然后又緩慢釋放；而出峰時間在60～70，90～100，100～110 min的成分則在1 h內(nèi)既已基本完全釋放，即滲透泵片對這一部分成分的控緩釋效果不好，如果這些成分是補陽還五湯的有效成分，則需對之采用另外的方法進行控制；出峰時間在20～30 min的成分則在1 h內(nèi)較少釋放，而在3～5 h

釋放量較大；其余各段出峰時間的成分則基本在穩(wěn)定釋放，在一定程度上達到了控釋且整體同步受控的效果。

4討論

本研究對自制補陽還五滲透泵緩釋片體外釋放情況進行了考察，對其不同釋放時間樣品指紋圖譜按出峰時間進行分段，采取總量統(tǒng)計矩原理計算其段帶相似度，從指紋圖譜數(shù)據(jù)及計算獲得的相似度數(shù)據(jù)可以看出，采取滲透泵原理制備的補陽還五緩釋片中多數(shù)成分能夠?qū)崿F(xiàn)“整體受控、同步釋放”的目的，一定程度上使之符合中藥用藥的特點，能夠順應(yīng)中藥多成分群藥物動力學(xué)行為調(diào)整的需要，但也可看出由于滲透泵片依賴滲透壓控制的原理，藥物的釋放并不能夠完全切合中藥復(fù)方用藥之精髓，仍需進一步探求適合于中藥多成分的控緩釋制劑制備技術(shù)。當(dāng)然，補陽還五湯物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完全明確，前期大量研究表明[910]總苷、總苷元、總多糖、總生物堿為其主要活性成分，本研究自制補陽還五滲透泵緩釋片的主要目的系考察制劑中成分釋放的整體同步性，仍有較多制劑學(xué)的細節(jié)問題未納入本研究的探討范圍，需在后續(xù)研究中進一步探討。

再則，結(jié)合液相色譜原理及相似度評價結(jié)果，出峰時間接近的藥物具有相接近的釋藥行為，這符合了結(jié)構(gòu)相近可以具有相同的印跡模板的傳統(tǒng)理念。然而出峰時間在60～70，90～100 min的成分也具有相近的釋藥行為，這也能夠切合成分結(jié)構(gòu)不同，但如具有相同的印跡模板亦可呈現(xiàn)相同或相近的理化性質(zhì)及藥理作用，這在大量使用的化學(xué)藥中也已得到證實：如嗎啡、芬太尼及亮氨酸腦啡肽等結(jié)構(gòu)大不相同，但由于具有相同的印跡模板而具有相同的鎮(zhèn)痛作用，此外中藥復(fù)方在煎煮過程及從制劑中釋放的過程中均有表現(xiàn)出自組織、自組裝、自識別與自復(fù)制的明顯的超分子作用特征，同一中藥不同成分或不同中藥不同成分，在體內(nèi)能自組織、自組裝、自復(fù)制成超分子，能自識別作用于與“印跡模板”相一致的經(jīng)絡(luò)臟腑靶區(qū)產(chǎn)生藥效，因此在中藥控緩釋制劑研究過程中，如能認識中藥復(fù)方中的超分子印跡模板，將能通過印跡模板來控制不同成分的同步釋放，從而擺脫目前中藥多成分控緩釋制劑仍在借助單成分制劑制備技術(shù)，無法真正契合中藥復(fù)方用藥特點的現(xiàn)狀，開拓出適合于中藥多成分的控緩釋制劑制備技術(shù)。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]