RT－PCR檢測SALL4基因骨髓增生異常綜合征的表達①

武廣海，田黎明，于廣晴，張　純，袁嘉怡，申福國

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003;2鶴崗市人民醫(yī)院急救中心，黑龍江鶴崗154100)

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RT－PCR檢測SALL4基因骨髓增生異常綜合征的表達①

武廣海1，2，田黎明1，于廣晴1，張純1，袁嘉怡1，申福國1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003;2鶴崗市人民醫(yī)院急救中心，黑龍江鶴崗154100)

摘要:目的:探討骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓中SALL4mRNA表達及其臨床意義。方法:通過RT－PCR方法分別檢測13例難治性貧血患者(MDS－RA)、27例難治性貧血伴原始細胞增多患者(MDS－RAEB)和11例正常對照組骨髓單個核細胞(BMMNC)中SALL4mRNA表達情況，并比較MDS－RA和MDS－RAEB之間的表達差異。結(jié)果: MDS患者骨髓中SALL4 mRNA表達均明顯高于正常對照，且MDS－RAEB表達量高于MDS－RA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論: SALL4mRNA基因可能參與了MDS的發(fā)病，MDS－RA和MDS－RAEB之間的SALL4基因表達差異可能提示2者的發(fā)病機制的不同。

關(guān)鍵詞:SALL4mRNA;骨髓增生異常綜合征; RT－PCR

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一組髓系具有異質(zhì)性呈病態(tài)克隆性疾?。?］，其基本病變主要是造血干克隆性增生、祖細胞異常發(fā)育，往往累計數(shù)個造血系統(tǒng)(例如粒系、紅系和巨核系等)為主要特點的血液系統(tǒng)疾病; MDS臨床特征主要表現(xiàn)為造血異常、血細胞的質(zhì)與量出現(xiàn)異常，并有向急性白血病高危轉(zhuǎn)化的可能［2，3］。MDS目前扔沒有統(tǒng)一有效的治療方案，其臨床治療預(yù)后差，其疾病的病因和發(fā)病機制目前尚不明了。依據(jù)2008年最新WHO的分型修訂版中將MDS劃分為七型［4］:①難治性血細胞減少伴單系病態(tài)造血(RCUD )，②難治性貧血伴環(huán)狀鐵粒幼細胞(RARS )，③難治性血細胞減少伴多系病態(tài)造血(RCMD)，④難治性貧血伴原始細胞增多－1(RAEB －1)，⑤難治性貧血伴原始細胞增多－2(RAEB－2)，⑥MDS－未分類(MDS－U )，⑦MDS伴單純5q－。而在實際的臨床工作中既往FAB協(xié)作組分型仍在使用，其MDS－RA和RAEB類型在臨床診斷和治療中更易見。

婆羅雙樹樣基因4(SALL4)是最近研究發(fā)現(xiàn)的一種新的致癌基因，SALL4是婆羅雙樹樣基因家族的最新成員，最早是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的婆羅雙樹樣基因之一，SALL4是具有多個C2H2結(jié)構(gòu)的序列的一種蛋白轉(zhuǎn)錄因子［5］。有研究表明SALL4在生殖細胞腫瘤、肝樣胃癌等腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有重要意義［6，7］。而到目前為止，國內(nèi)外對對MDS患者體內(nèi)SALL4基因及其蛋白表達的研究報道較少。本研究主要采用PCR方法對臨床較為常見MDS－RA和RAEB類型的MDS患者的外周SALL4 mRNA的表達情況進行了檢測，以初步探討MDSRA和RAEB類型的MDS患者SALL4mRNA表達水平及其臨床意義。

1　資料和方法

1.1一般資料

選擇2012－12～2014～09在我院血液科就診的40例骨髓增生異常綜合征(MDS)患者其中男21例，女19例，年齡36～74歲，平均54.3歲。其中收集難治性貧血(MDS－RA)患者13例，難治性貧血伴原始細胞增多(MDS－RAEB)患者27例，所有患者診斷依據(jù)張之南主編的《血液病學(xué)》的MDS診斷標(biāo)準確診［1］。隨機選取健康體檢人11例作為對照組，其中男7例，女4例，年齡30～57歲。

1.2主要材料及試劑

PCR擴增儀(美國BIO－BAD公司) ;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳槽(北京六一實驗儀器廠) ;超凈工作臺(蘇州凈化廠) ; 0.02% EDTA(Sigma，美國) ; MarkerDL50(武漢博士德) ; cDNA第一鏈合成試劑盒、RT－PCR擴增試劑盒(天津市灝洋生物)。

1.3骨髓樣本的處理

在無菌條件下取患者和健康查體的3mL新鮮骨髓液加入含肝素的抗凝管中，首先滴加適量PBS液稀釋，再次加入Ficoll淋巴細胞分離液(體積比1: 1混合)，混合均勻后離心(1500rpm)，離心20min，棄上清液后，留取中間白膜層的單個核細胞，取中間層液體再次加入PBS緩沖液沖洗，混合均勻后離心(2000rpm0，離心10min，留中間層后加入PBS緩沖液沖洗后放置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA的提取和cDNA合成

取上述標(biāo)本，加入500μL的Trizol反復(fù)震蕩搖勻、靜置5min后加入0.2mL氯仿、1200rpm低溫離心15min，取上清液加入等體積異丙醇混合均勻，30min后再次低溫離心，棄上清加入75%乙醇震蕩后再次低溫7500rpm離心10min，棄上清部分檢測RNA濃度，其余RNA置于－40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述獲得RNA標(biāo)本產(chǎn)物，參閱文獻［8］中相關(guān)經(jīng)驗，嚴格按照cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA產(chǎn)物置于－40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR反應(yīng)

(1)反應(yīng)體系取25uL反應(yīng)液其包括:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA) 2μL，上游引物和下游引物各1μL、Magic-Mix液12.5μL;其余用蒸餾水配置至25μL。(2) SALL4基因的擴增反應(yīng)條件為:開始95℃變性4min，其次95℃變性30s，再次61℃退火30s，緊接著72℃延伸1min，方法同上進行35個循環(huán)后72℃延伸5min，反應(yīng)結(jié)束。(3)β－actin的擴增條件同SALL4基因過程。

表1　引物詳情

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計描述用均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示，不同組別間采用單純性方差分析，(P＜0.05)表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

SALL4 mRNA在MDS－RAEB、MDS－RA、正常對照組的表達及其ODR值SALL4 mRNA RT－PCR產(chǎn)物大小為282bp，內(nèi)參β－actin為127bp，其基因表達產(chǎn)物泳帶見圖1。SALL4基因在正常對照組無表達未見電泳條帶;在MDS－RAEB和MDS－RA組中可見表達，其電泳條帶清晰，但是MDS－RAEB組表達較MDS－RA組高。見圖1。

通過其quelity one灰度分析軟件對所有條帶進行灰度分析SALL4基因與β－actin基因擴增產(chǎn)物電泳帶的灰度比值(ODR)發(fā)現(xiàn)，正常對照組SALL4mRNA相對ODR值與MDS－RAEB組、MDS －RA組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) ; MDS －RAEB組較MDS－RA組相比較明顯較高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖1　各組患者RT－PCR電泳

圖2　實驗組中SALL4 /β－actin比值(ODR值) 注:*表示P＜0.05

3　討論

MDS在各年齡段人群均可發(fā)病，其中以老年居多，其每年發(fā)病率約為15/10萬～50/10萬，但是隨著醫(yī)療科學(xué)的發(fā)展和社會老齡化加其每年的發(fā)病率具有上升的趨勢［2］。由于目前對MDS的發(fā)病機制及其向急性白血病轉(zhuǎn)化的機制還不十分明確，導(dǎo)致目前對該病的診斷難度大，治療效果差。

SALL4是最新研究發(fā)現(xiàn)婆羅雙樹樣基因(SALL)家族中的致癌基因之一，該基因是果蠅Spalt的同源異型基因;有研究表明SALL4基因中含有4個外顯子，它們分別編碼后可產(chǎn)生兩種蛋白即SALL4A蛋白和SALL4B蛋白，該蛋白物質(zhì)也具有婆羅雙樹樣基因家族成員結(jié)構(gòu)相似［5］。有研究發(fā)現(xiàn)LEF1和TCF4F能有效激活SALL4轉(zhuǎn)錄，從而激活經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，e－myc細胞周期蛋白D1(CyclinD1)基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP－7)為Wnt信號的靶基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用，提示SALL4基因具有導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的潛能同時SALL4具有維持干細胞特性的作用和致瘤的潛能［9］。

有研究發(fā)現(xiàn)在很多生殖系統(tǒng)［10］(如卵黃囊瘤、無性細胞瘤、精原細胞瘤等腫瘤)中均發(fā)現(xiàn)SALL4異常表達;馬從乾［11］等人研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的肝癌組織中SALL4的蛋白呈現(xiàn)高表達; SALL4的表達量與患者性別、年齡、腫瘤大小等因素?zé)o相關(guān)性。有學(xué)者通過SALL4轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)［12］，在過度表達的動物出生14～24d可見骨髓異常增生活躍現(xiàn)象同時也可見造血細胞過度凋亡現(xiàn)象，還在動物外周血中發(fā)現(xiàn)紅系和粒系數(shù)量的減低;在實驗動物出生后6～8個月時可見很多未成熟的原始細胞、血小板、有核紅細胞等表現(xiàn)，這些均為典型的MDS樣病態(tài)造血相，此時還可見約有半數(shù)的實驗動物最終轉(zhuǎn)化為了急性白血病。然而又有學(xué)者在白血病中研究SALL4基因證實，SALL4蛋白可以通過與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)進行復(fù)雜的一些列的反應(yīng)過程后可抑制PTEN，進而促進白血病的進一步發(fā)展;在實驗中他們加入一種活性肽來拮抗抑制SALL4蛋白與組蛋白脫乙酰酶的反應(yīng)，可以有效的解除對PTEN抑制，促進了具有SALL4蛋白高表達的惡性腫瘤細胞凋亡［13］。

本實驗主要是通過RT－PCR方法測定MDS患者骨髓的單個核細胞標(biāo)本中SALL4 mRNA含量，本實驗研究發(fā)現(xiàn)正常對照組樣本中PCR結(jié)果未見電泳條帶，這也說明正常對照組的骨髓單個核細胞中SALL4 mRNA基本未見表達，而在在MDS－RAEB 和MDS－RA組中可見表達，其電泳條帶清晰可見，但是MDS－RAEB組中SALL4 mRNA含量灰度值較MDS－RA組高，這也說明在MDS組實驗樣本的骨髓單個核細胞中ALL4 mRNA呈現(xiàn)高表達水平，這與對照組比較有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，這正與段夢夕［14］和丁柳美等［15］人的研究結(jié)果基本一致。丁柳美等人研究發(fā)現(xiàn)MDS患者的外周血和骨髓中SALL4mRNA表達均明顯高于對照，且骨髓標(biāo)本較外周血標(biāo)本表達強;他們還在MDS各亞型中研究發(fā)現(xiàn)，各亞型之間有統(tǒng)計學(xué)差異，且在RAEB－Ⅰ及RAEB－Ⅱ這兩個亞型標(biāo)本中具有較強的表達。然而本實驗則是把MDS中的RA與RAEB兩種臨床中最常見的亞型進行比較，本實驗研究發(fā)現(xiàn)MDS－RA組患者骨髓樣本中SALL4 mRNA含量表達水平明顯高于正常對照組患者骨髓樣本中表達量，MDS－RAEB組患者骨髓樣本中SALL4 mRNA含量表達水平高于MDS－RA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。上述實驗研究結(jié)果提示了SALL4基因在正常對照組和MDS中RAEB－Ⅰ和、RAEB－Ⅱ這兩個亞型之間表達存在明顯差異，這對于臨床上MDS的診斷和分型提供了實驗依據(jù)，SALL4基因的檢測將來可能作為判斷骨髓增生異常綜合征患者發(fā)病及其協(xié)助分型的指標(biāo)之一。

目前對于SALL4基因功能和引起MDS發(fā)生機制的研究目前仍然處于初級階段，雖然有文獻研究表明，SALL4基因在MDS患者身上可以檢測到該基因的表達有一定的相關(guān)性。本實驗深入地探討SALL4基因在MDS常見亞型中表達情況，對于探討MDS的具體發(fā)病機制及今后更準確地診斷和靶向治療惡性血液病提供潛在的新途徑。本實驗研究雖然發(fā)現(xiàn)SALL4基因在對照組無表達，MDS－RAEB組和MDS－RA高表達，且前者高于后者;但是本次實驗由于收集測定的標(biāo)本較少、其他分型也未檢測，未連續(xù)進行病例跟蹤檢測，因此我們需要進一步擴大實驗樣本填補實驗樣本的偏少帶來的不足。

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Detection of SALL4 mRNA expression in myelodysplastic syndrome by RT－PCR

WU Guang－h(huán)ai1，2，TIAN Li－ming1，YU Guang－qing1，ZHANG Chun1，YUAN Jia－yi1，SHEN Fu－guo1
(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China; 2.The Eemergency Center of Hegang People’s Hospital，Hegang 154100，China)

Abstract:Objective: To investigate the expression of SALL4 mRNA and its clinical significance on myelodysplastic syndrome (MDS) patients with bone marrow SALL4 mRNA Expression and clinical significance.Methods: RT－PCR，13 cases were detected in patients with refractory anemia (MDS－RA).，27 patients with refractory anemia with excess blasts in patients (MDS－RAEB) and 11 cases of normal bone marrow mononuclear cells (BMMNC ) in SALL4mRNA expression and compared expression differences between MDS－RA and MDSRAEB betwee.Results: SALL4 mRNA expression in MDS patients were significantly higher than that in the control group.，aAnd MDS－RAEB higher expression of MDS－RA，the difference was statistically significant (P＜0.01).Conclusion: SALL4mRNA gene may be involved in the pathogenesis of MDS，SALL4 gene expression between differences MDS－RA and MDS－RAEB may suggest different pathogenesis.between two persons may suggest different pathogenesis.

Key words:SALL4mRNA; myelodysplastic syndrome; RT－PCR

(收稿日期:2015－03-04)

通訊作者:田黎明(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: TLM3388@163.com。

作者簡介:①武廣海(1975～)男，黑龍江鶴崗人，在讀碩士研究生。

中圖分類號:R551.3

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0096－03