奧拉西坦對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后RGMa的表達(dá)①

丁蘭蘭，王顯鶴，劉喜鳳，楊占雙，吳祥紅，王　嬌，聶　影

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007; 2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

?

奧拉西坦對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后RGMa的表達(dá)①

丁蘭蘭1，王顯鶴2，劉喜鳳1，楊占雙2，吳祥紅2，王嬌2，聶影2

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007; 2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic－－ischemic brain damage，HIBD)模型，檢測HIBD大鼠腦組織中排斥導(dǎo)向因子A(RGMa)的表達(dá)變化，探討奧拉西坦對HIBD大鼠RGMa表達(dá)的影及其對神經(jīng)損傷的修復(fù)及保護(hù)作用。方法:將135只新生7d齡Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組，45只)，缺氧缺血組(HIBD組，45只)和奧拉西坦治療組(45 只)，每組分為12h、24h、48h、72h、7d五個亞組。sham組只做左側(cè)頸總動脈分離，不做缺氧處理，HIBD組及奧拉西坦組做左側(cè)頸總動脈結(jié)扎及缺氧處理，分別于術(shù)后腹腔注射生理鹽水0.1mL/kg和奧拉西坦100mg/kg，分別于術(shù)后12h、24 h、48 h、72 h、7d斷頸處死大鼠。免疫組化檢測皮質(zhì)及海馬中RGMa表達(dá)。結(jié)果: sham組，可見RGMa有微量表達(dá)，各組間無統(tǒng)計學(xué)意義; HIBD組: RGMa陽性細(xì)胞在造模12h開始表達(dá)，24h升高，48h達(dá)高峰，此后逐漸降低，與sham組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，奧拉西坦治療組各時間點RGMa表達(dá)均低HIBD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，HIBD組和奧拉西坦治療組陽性細(xì)胞數(shù)均多于sham組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論: HIBD時腦組織中RGMa表達(dá)增多，參與腦損傷，奧拉西坦能通過抑制RGMa大量表達(dá)從而促進(jìn)受損神經(jīng)的再生與修復(fù)。

關(guān)鍵詞:缺氧缺血性腦損傷;奧拉西坦; RGMa

HIBD是新生兒窒息后產(chǎn)生的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，迄今仍是導(dǎo)致新生兒死亡和永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的原因。HIBD后中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后神經(jīng)元再生困難，主要是因為軸突生長抑制因子妨礙了受損神經(jīng)的的再生，RGMa(Repulsive guidance molecule )是一種新的具有排斥及誘導(dǎo)生長錐塌陷的軸突再生抑制蛋白。本課題是利用新生大鼠HIBD模型來探奧拉西坦對RGMa的影響及其對神經(jīng)再生的促進(jìn)作用。

1　材料與方法

1.1材料

清潔級7d齡Wistar新生大鼠，體重(12.5± 3) g，雌雄不限，均由佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供，奧拉西坦注射液購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，RGMa購自北京博奧森生物工程有限公司，免疫組化試劑盒，DAB顯示劑購于武漢博士德生物工程有限公司;混合氣體(氮氣: 920mL/L，氧氣: 80mL/L) :佳木斯市金鼎氧氣。

1.2分組與造模

將135只新生7d齡Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分3組，假手術(shù)組(sham組)，缺氧缺血組(HIBD 組)，奧拉西坦治療組，每組45只，每組再分為12h、24h、48h、72h、7d六個亞組。Sham組只做左側(cè)頸總動脈分離，不做結(jié)扎。HIBD組和奧拉西坦組參照Rice法建立HIBD模型，新生鼠乙醚吸入麻醉，仰臥膠布固定于手術(shù)板上，常規(guī)酒精消毒。于頸部正中縱行切口，用玻璃分針鈍性分離皮下組織和肌肉，游離并暴露左側(cè)頸總動脈后，用4－0號線結(jié)扎，縫合切口，碘伏消毒局部皮膚后，返回母鼠身邊恢復(fù)1h后，置于自制37°恒溫缺氧倉內(nèi)，以2L/min的速度輸入含92%氮氣和8%氧氣的混合氣體，持續(xù)2h。HIBD組和奧拉西坦組分別于術(shù)后10min腹腔注射生理鹽水0.1mL/kg和奧拉西坦100mg/kg，之后每日一次，分別與12h、24h、48h、72h、7d斷頸處死。

1.3取材

三組均與造模后12h、24h、48h、72h、7d各處死9只大鼠，心臟灌注后斷頭取全腦，并立即將腦組織保存于4%的多聚甲醛0.1mol/L PBS的(pH 7.4)溶液中，固定72h以上。之后把固定的鼠腦從視交叉后2～6mm處做腦組織的冠狀切面，取其腦組織脫水石蠟包埋。用石蠟切片機(jī)將蠟塊連續(xù)切片，片厚約3μm，每5張取一張片作免疫組織化學(xué)，取部分做HE染色。

1.4腦組織病理形態(tài)

HE染色法觀察新生大鼠各時間點腦組織形態(tài)變化。

1.5 RGMa免疫組化染色

各組各時間點的腦組織切片分別用兔抗RGMa抗體作為一抗，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，以PBS代替一抗作為對照。RGMa陽性為胞質(zhì)染成淺黃色、棕黃色或者棕褐色.采用陽性細(xì)胞計數(shù)法，每張切片分別隨機(jī)選取海馬及皮質(zhì)6個不重疊視野(×400)，在同一光強(qiáng)度下，計數(shù)RGMa陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞數(shù)百分比，取平均值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS.17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對各組的數(shù)據(jù)給予正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗比較各組數(shù)據(jù)均數(shù)，進(jìn)行單因素方差，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肉眼觀察大鼠腦組織形態(tài)

sham組大鼠腦組織形態(tài)正常，HIBD組隨造模時間延長，可見左側(cè)大腦出現(xiàn)水腫、壞死病灶，結(jié)扎側(cè)的腦半球形態(tài)發(fā)生改變。而奧拉西坦治療組腦組織水腫程度較HIBD組輕，未見液化壞死灶。

2.2腦組織病理變化

sham組腦組織各部位形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞層次清楚，形態(tài)正常。HIBD組隨著造模時間延長，依次出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、神經(jīng)元排列紊亂、細(xì)胞核固縮、碎裂及壞死灶周圍炎性細(xì)胞增多。奧拉西坦治療組各時間點細(xì)胞腫脹及核固縮、碎裂溶解的細(xì)胞數(shù)均少于HIBD組。

2.3 RGMa表達(dá)

在sham組可見少量RGMa陽性細(xì)胞; HIBD組RGMa陽性細(xì)胞數(shù)于造模12h后可見棕黃色陽性表達(dá)，24h表達(dá)升高，至48h達(dá)高峰，之后維持高濃度，較前逐漸下降。奧拉西坦治療組RGMa陽性細(xì)胞表達(dá)部位及變化規(guī)律與HIBD組相似，陽性細(xì)胞數(shù)在各時間點的表達(dá)均低于HIBD組，與HIBD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與sham組比較，HIBD組和奧拉西坦治療組陽性細(xì)胞數(shù)均多于sham組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1，圖1。

表1　各組不同時間點RGMa陽性細(xì)胞數(shù)(%)比較(±s，n =9)

表1　各組不同時間點RGMa陽性細(xì)胞數(shù)(%)比較(±s，n =9)

注:與sham組比較，aP＜0.05，b與HIBD組比較P＜0.05。

組別12h　24h　48h　72h　7d sham組　6.00±2.57　6.17±2.38　6.73±2.88　6.59±2.41　6.96±2.43 HIBD組　26.47±2.90a　32.28±5.91a　58.59±6.51a　51.30±5.94a　40.40±5.45a奧拉西坦組　22.28±3.00ab　27.74±5.63ab　52.42±6.40ab　40.76±5.80ab　28.44±3.32abF值　265.67　145.49　473.14　394.34　332.48 P ＜0.05　　＜0.05　?。?.05　?。?.05　?。?.05

圖1　sham組、HIBD組、奧拉西坦治療組大鼠大腦皮質(zhì)不同時間點RGMa表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色×200)

3　討論

HIBD是由多種原因引起的腦缺氧和(或)腦缺血性損傷，可引起新生兒圍生期腦損傷和長期神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重后遺癥，其后遺癥的發(fā)生與神經(jīng)再生障礙關(guān)系密切。CNS損傷后神經(jīng)再生修復(fù)能力，不僅與神經(jīng)元自身的再生能力有關(guān)，還受神經(jīng)元所處的生存環(huán)境中的各種外源性的生長促進(jìn)因子和抑制性因子的共同影響。近年來研究比較多的RGMa蛋白，是一種排斥性軸突導(dǎo)向分子，可存在于脈絡(luò)叢、成熟髓磷脂和正形成的瘢痕等干擾軸突生長的結(jié)構(gòu)中，通過與其受體Neogenin結(jié)合，激活RhoA－Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使神經(jīng)元軸索內(nèi)細(xì)胞骨架重排、生長錐塌陷，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、再生“流產(chǎn)”［1］。在本研究中，我們以新生7d齡Wistar大鼠為對象建立HIBD模型，觀察當(dāng)發(fā)生缺氧缺血性腦損傷時RGMa的表達(dá)變化來評估軸突損傷及再生情況。在sham組，在新生大鼠的海馬區(qū)、大腦皮層的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞可見RGMa陽性細(xì)胞表達(dá)，表明RGMa存在于正常的腦組織中，并且可能參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生長調(diào)控。HIBD組，12h可見RGMa陽性細(xì)胞表達(dá)，24h升高，于48h達(dá)高峰，之后維持高濃度，并較前逐漸降低。由此推測RGMa在腦損傷急性期表達(dá)增加，抑制軸突再生，并且當(dāng)RGMa達(dá)峰值時，其對軸突再生的抑制最大，隨著RGMa的降低，其對軸突的抑制作用逐漸降低。奧拉西坦可以選擇性的作用于大腦皮層和海馬，能夠改善腦水腫，保護(hù)受損細(xì)胞，激活和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)，是一種新的中樞神經(jīng)系統(tǒng)益智藥。張洋［2］等通過實驗證明奧拉西坦可以改善新生大鼠HIBD模型腦水腫。多項臨床實踐［3～5］證明奧拉西坦在治療腦卒中，老年癡呆，腦梗死等取得了很好的治療效果。有研究［6］將奧拉西坦應(yīng)用于新生兒缺氧缺血性腦病，取得了良好的治療效果。國外學(xué)者［7］通過研究表明，在大鼠脊髓損傷模型中，使用RGMa特異性抗體后，結(jié)果表明RGMa抗體能夠綜合RGM，促進(jìn)軸突生長。Feng J等［8］通過實驗證實，在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型中RGMa蛋白在缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬升高，通過給予RGMa特異性RNAi后可顯著促進(jìn)軸突再生，改善大鼠的神經(jīng)功能。近年來多項研究［9～12］表明，通過給予藥物干預(yù)，可促使RGMa表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。本實驗結(jié)果表明奧拉西坦治療組無論在肉眼觀察大鼠的腦體形態(tài)，還是HE染色結(jié)果均顯示，應(yīng)用奧拉西坦后腦組織的損傷程度均低于HIBD組;免疫組化結(jié)果顯示奧拉西坦組RGMa陽性細(xì)胞數(shù)在各個時間點均低于HIBD組，提示給予奧拉西坦后可能抑制RGMa的表達(dá)。目前未見有關(guān)奧拉西坦在HIBD中對RGMa的影響的報道。綜上所述，在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的試驗中，奧拉西坦可能通過下調(diào)RGMa的表達(dá)，促進(jìn)軸突再生和修復(fù)。但是奧拉西坦下調(diào)RGMa的機(jī)制目前尚不清楚，這需要我們今后進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn):

［1］ChakrabortyG，Jain S，Kundu GC，et al.Osteopontin promotes vascular endothelial growth factor－dependent breast tumor growth and angiogenesis via autocrine and paracrine mechanisms［J］.Cancer Res，2008，68(1) : 152－161

［2］張洋，白莉，顧鏡月，等.奧拉西坦對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后AQP－4表達(dá)的影響［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2015，38(3) : 80－81

［3］馬小琦.奧拉西坦治療卒中后認(rèn)知功能障礙患者的療效觀察［J］.中國民康醫(yī)學(xué)2015，27(19) : 59－60

［4］楊學(xué)東.奧拉西坦在老年性癡呆治療中的療效探討［J］.中外醫(yī)療，2015(29) : 124－125

［5］閆靜.奧拉西坦對腦梗死恢復(fù)期患者輕度認(rèn)知功能障礙的影響分析［J］.中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2015，24(9) : 969－970

［6］鄭志紅.奧拉西坦注射液治療新生兒缺氧缺血性腦病療效觀察［J］.中國社區(qū)醫(yī)師，2012，29(14) : 110

［7］Hata K，F(xiàn)ujitani M，Yasuda Y，et al.RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury［J］.J Cell Biol，2006，173(1) : 47－58

［8］Feng J，Wang T，Li Q，et al.RNA interference against repulsive guidance molecule A improves axon sprout and neural function recovery of rats after MCAO/reperfusion［J］.Exp Neurol，2012，238(2) : 235－242

［9］Kitayama M，Ueno M，Itakura T，et al.Activated microglia inhibit axonal growth through RGMa［J］.PLoS One，2011，6(9) : 25234

［10］趙旭，薛承景，李雪，等.丁基苯酞對大鼠彌漫性腦損傷后排斥性導(dǎo)向分子表達(dá)的影響［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2015，18 (2) : 284－288

［11］陶濤，秦新月，馮金洲.低劑量米諾環(huán)素對腦缺血再灌注大鼠RGMa表達(dá)的影響［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2015，41(3) : 141－144

［12］陶濤，秦新月，徐廣會.養(yǎng)血清腦顆粒對大鼠腦缺血再灌注損傷后軸突再生及RGMa表達(dá)的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2013，35(7) : 635－638

(收稿日期:2015－12－18)

通訊作者:王顯鶴(1966～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: 312037443@ qq.com。

作者簡介:丁蘭蘭(1990～)女，山東濟(jì)寧人，在讀碩士研究生。

基金項目:①1.佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號: LM2015_024 ; 2.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)校級面上項目，編號: S2014－008。

中圖分類號:R743

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0018－03