Balb/c3T3細胞體外轉(zhuǎn)化實驗方案的優(yōu)化①

朱金玲，田　銳，張　虎，張金波，張淑紅，金岳雷，扈清云

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

?

Balb/c3T3細胞體外轉(zhuǎn)化實驗方案的優(yōu)化①

朱金玲，田銳，張虎，張金波，張淑紅，金岳雷，扈清云

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

摘要:目的:優(yōu)化Balb/c3T3細胞轉(zhuǎn)化實驗。方法:將不同濃度的血清及改良的培養(yǎng)基分別作用于鼠成纖維細胞Balb/c3T3，選擇不同的時間點，通過細胞形態(tài)學(xué)觀察和集落實驗，對小鼠成纖維細胞Balb/c3T3的致癌效果的分析。結(jié)果:改良的操作程序和培養(yǎng)基，培養(yǎng)的細胞－細胞轉(zhuǎn)化時間縮短，表現(xiàn)出更強的集落形成能力，顯示出高度的成瘤性。結(jié)論:改良的操作程序和培養(yǎng)基的方法可縮短實驗周期，節(jié)省人、財、物力。

關(guān)鍵詞:Balb/c3T3細胞;細胞轉(zhuǎn)化;細胞集落實驗; ITES

腫瘤已成為嚴重威脅人類生命與健康的疾病，大多數(shù)腫瘤是由環(huán)境致癌物引起的。20世紀60年代以來，體外細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展成熟，人們開始用離體培養(yǎng)細胞對環(huán)境污染物進行毒性評價［1，2］。體外檢測技術(shù)是近年來逐漸發(fā)展和成熟起來的一種有效的篩選和檢測環(huán)境污染物的方法，主要包括染色體畸變試驗－微核試驗、DNA損傷檢測－單細胞凝膠電泳技術(shù)(即彗星試驗)、體外細胞轉(zhuǎn)化試驗等［3］，其中體外哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化試驗已被國際癌癥研究中心、歐洲替代方法研究中心、全國危險化學(xué)品管理標準化技術(shù)委員會等眾多機構(gòu)評價為一種有效的篩選致癌物的方法［3～6］。體外哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化試驗是利用動物細胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境下，模擬致癌物在體內(nèi)致瘤的作用進行致癌物檢測的一種技術(shù)。目前唯一直接評價致癌物毒性的體外試驗方法是體外細胞轉(zhuǎn)化試驗，該方法通過對模型細胞染毒，使正常細胞啟動轉(zhuǎn)化后，進入促長階段，經(jīng)五周以上的培養(yǎng)，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)，計算轉(zhuǎn)化克隆數(shù)，改方法實驗周期長，轉(zhuǎn)化頻率低，實驗成本較高。為此，為縮短檢測時間，提高環(huán)境致癌物的檢測效率，降低成本，我們對Balb/c3T3細胞體外轉(zhuǎn)化實驗方案進行了優(yōu)化，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞

小鼠胚胎成纖維細胞BALB/3T3 clone A31，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.1.2主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，Gibco公司;葡萄糖、HEPES，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，N－甲基－N－硝基－N－亞硝基胍(N－me thy－lN－nitro －N－n itrosoguan id ine，MNNG)、佛波酯(12－O －tetradecanoy－l phorbo－l 13－ace tate，TPA)、 DMSO、ITES，Sigma公司;低熔點瓊脂糖，Solarbio公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)化實驗

實驗分為8組，第1組是TPA處理組:將細胞以1X104/皿接種于直徑為6cm平皿中，每個處理組平行接種3皿，37℃，5%CO2濕箱中培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基血清濃度為10%，培養(yǎng)24h后加入N－甲基－N－硝基－N－亞硝基胍(MNNG) 1μg/mL，4h后換培養(yǎng)基除去MNNG，繼續(xù)培養(yǎng)7d，于接種后第8天加入濃度為0.1μg /mL的TPA繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次，同時補加TPA，第22天除去TPA，第27天甲醇固定細胞，10%的Giemsa染液染色，觀察細胞形態(tài)及轉(zhuǎn)化灶。第2組是MNNG對照組:用0.2%的DMSO代替TPA，第3組是DMSO對照組:用DMSO代替MNNG和TPA，其他方法同TPA處理組。第4組是正常完全培養(yǎng)基DMEM組:不加任何藥品。第5～8組按照1～4組處理，不同的是每組在第8天添加的是改良的DMEM培養(yǎng)基，其含有1%ITES(含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺和亞硒酸鈉4種因子)和含2%的胎牛血清，且第14天除去TPA，第19天甲醇固定細胞，10%的Giemsa染液染色，觀察細胞形態(tài)及轉(zhuǎn)化灶。

1.2.2軟瓊脂集落實驗

對以上8組細胞培養(yǎng)結(jié)束時，制成500個活細胞/mL的細胞懸液。取1mL已融化1.2%低熔點瓊脂置于6孔板中，作為底層瓊脂，然后取0.5mL細胞懸液分別加入已融化0.7%低熔點瓊脂0.5mL中混勻。然后移入6孔培養(yǎng)板，置5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃進行培養(yǎng)7～10d，利用倒置顯微鏡進行觀察?？梢姷募毎麍F(含50個以上細胞)作為計數(shù)集落的標準。

1.2.3轉(zhuǎn)化結(jié)果判定方法

體外細胞轉(zhuǎn)化試驗是以細胞形態(tài)惡性轉(zhuǎn)化為檢測終點。對轉(zhuǎn)化細胞的判定通常采用細胞灶法，計數(shù)克隆數(shù)，觀察鑒定轉(zhuǎn)化灶，單盲法觀察，由2人共同認定。轉(zhuǎn)化灶的判定標準:正常細胞灶，灶內(nèi)細胞排列規(guī)則，束狀，細胞灶外圍區(qū)的細胞單層生長，規(guī)則。轉(zhuǎn)化細胞灶，灶內(nèi)細胞由正常的長梭形變?yōu)槎趟鬆?，失去接觸抑制，呈復(fù)層生長，排列紊亂，形成交叉和旋渦。吉姆薩染色惡性轉(zhuǎn)化灶細胞嗜堿深染，致密多層，自由定向生長。

2　結(jié)果

2.1細胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)及轉(zhuǎn)化灶的吉姆薩染色觀察

細胞邊緣可見光亮狀，細胞排列雜亂無序，周圍細胞呈明顯的放射狀分布;加入含ITES培養(yǎng)基培養(yǎng)后細胞生長速度與未添加組分對比明顯升高，且細胞周圍接觸抑制均無，細胞雜亂無序重疊生長，可見典型的形態(tài)轉(zhuǎn)化灶。

圖1　上組圖為27d各組的細胞形態(tài)，下組圖為第19天各組的細胞形態(tài)

如圖1所示，正常轉(zhuǎn)化組與改良培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化組比較，ITES組總體轉(zhuǎn)化效率提高，轉(zhuǎn)化時間縮短，且加入ITES的MNNG－TPA組惡性程度極高。

2.2軟瓊脂集落實驗

除MNNG－TPA組外其余組的細胞表現(xiàn)出非惡性及非侵襲性特點，在軟瓊脂細胞集落形成實驗中顯示出無或極少數(shù)細胞集落形成。而MNNG－TPA組有部分細胞集落出現(xiàn)，而含ITES培養(yǎng)基培養(yǎng)的MNNG－TPA組細胞表現(xiàn)出高于正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的MNNG－TPA組細胞的細胞集落形成率。所有含ITES培養(yǎng)基培養(yǎng)的MNNG－TPA組細胞均顯示出更強的集落形成能力，顯示出高度的成瘤性。

3　討論

1985年IARC對以BALB c 3T3細胞為基礎(chǔ)的細胞轉(zhuǎn)化方法進行了系統(tǒng)的評估，提出了細胞轉(zhuǎn)化實驗標準方法，該方法雖能有效檢測環(huán)境致癌物，但是存在著實驗周期長、轉(zhuǎn)化頻率低，實驗成本較高等不足［8］。為縮短檢測時間，提高環(huán)境致癌物的檢測效率，降低成本，我們對Balb/c3T3細胞體外轉(zhuǎn)化實驗方案進行了優(yōu)化，對操作程序和培養(yǎng)基進行了改進，將培養(yǎng)基加入1%ITES(含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺和亞硒酸鈉4種因子)。在各期的形態(tài)學(xué)觀察中我們發(fā)現(xiàn):接種初期細胞死亡比較明顯，在第一次加入MNNG后細胞開始出現(xiàn)大量死亡或貼壁不牢固的現(xiàn)象，7d后加入TPA以后細胞開始出現(xiàn)第二次大量死亡，14d后，細胞開始大量增值，死亡數(shù)量明顯減少。但加入ITES培養(yǎng)后細胞數(shù)量MNNGTPA組細胞數(shù)量大于不加ITES組，其余均少于不加ITES組。

正常未加入藥品的組，細胞貼壁狀態(tài)好，細胞呈長梭形，胞質(zhì)清透，死亡率低;加入含ITES培養(yǎng)基培養(yǎng)后細胞生長速度緩慢，細胞貼壁效果不好細胞死亡數(shù)量較大。陰性對照DMSO組中，細胞生長受到抑制，生長速度與正常組對比緩慢，且有部分細胞死亡貼壁狀態(tài)較正常組差，但少部分細胞落中間細胞呈方形，胞質(zhì)均勻，細胞核略變大，且細胞周圍呈圓亮;加入含ITES培養(yǎng)基培養(yǎng)后細胞生長速度、貼壁效果與DMSO組分基本一致，但死亡細胞數(shù)量明顯增多。MNNG－DMSO組中，細胞生長受到的抑制不明顯，細胞貼壁狀態(tài)較對照DMSO組差，但細胞死亡數(shù)量明顯減少，大部分細胞集落中間細胞呈方形，胞質(zhì)不均勻，細胞核變大，且細胞周圍呈圓亮。MNNG－TPA組中細胞生長速度最快，細胞團中間細胞間接觸抑制消失，胞質(zhì)渾濁，細胞核變大，常見雙核細胞。經(jīng)染色后觀察，正常組細胞、陰性對照DMSO組、陰性對照MNNG－DMSO組，細胞均存在接觸抑制，細胞生長呈長梭形，細胞單層生長，胞漿

和核染色較淺。而MNNG－TPA組細胞接觸抑制現(xiàn)象消失，細胞呈不規(guī)則形狀，細胞多層重疊生長，胞漿淡染，細胞核深染，且細胞呈侵襲生長。轉(zhuǎn)化灶呈放射狀生長，邊緣不整齊，符合Ⅲ型轉(zhuǎn)化灶的特征［7］。

結(jié)果顯示ITES可使轉(zhuǎn)化頻率提高，同時轉(zhuǎn)化灶出現(xiàn)時間提前，同時我們調(diào)整降低DMEM培養(yǎng)基中的胎牛血清(FCS)濃度，最低調(diào)整到2%，實驗結(jié)果與傳統(tǒng)采用10%FCS的DMEM培養(yǎng)的方法相比，調(diào)整后的方法可將轉(zhuǎn)化實驗周期縮短至3周，且較低的血清濃度可以降低血清批次差別對轉(zhuǎn)化實驗重現(xiàn)性的影響。結(jié)果表明使用DMEM + 2% FCS + 1% ITES培養(yǎng)的效果最好，實用可行，節(jié)省了人、財、力。后續(xù)我們將用該方法檢測毒物驗證其效果。

參考文獻:

［1］Dimitrov S D，Mekenyan O G，Sinks G D，et al.Global modeling of narcotic chemicals: ciliate and fish toxicity［J］.Journal of Molecular Structure: Theochem，2003，622(1－2) : 63－70

［2］李磊，楊雨晗，王雙，等.細胞活性檢測方法之比較［J］.生物學(xué)雜志，2011，28(1) : 87－93

［3］BOLEY S E，MCMANUS T P，MAHER V M，et al.Malignant transformation of human fibroblast cell strain MSU－1 1 by NMethyl－N－nitrosourea: Evidence of eliminationof p53 by homologous recombination［J］.Cancer Res，2000，60(15) : 4105－4111

［4］Vanparys P，Corvi R，Aardema M，et al.ECVAM prevalidation of three cell transformation assays［J］.Altex，2010，28: 56－59

［5］Sakai A，Sasaki K，Hayashi K，et al.An international validation study of a Bhas 42 cell transformation assay for the prediction of chemical carcinogenicity［J］.Mutat Res，2011，725(1－2) : 57

［6］Stuart Creton，Marilyn J，Aardema1，et al.Cell transformation assays for prediction of carcinogenic potential: state of thescience and future research needs［J］.Mutagenesis，2012，27: 93－101

［7］Tsuchiyat，Umedam.Improvement in the efficiency of the in vitro transformation assay method using BALB 3T3 A31－1－1 cells［J］.Carcinogensis，1995，16(8) : 1887－1894

［8］張磊，曾毅.Balb/c3T3細胞體外轉(zhuǎn)化實驗及其在環(huán)境致癌物檢測上的應(yīng)用［J］.衛(wèi)生研究，2009，38(2) : 226－231

(收稿日期:2015－12－18)

通訊作者:扈清云(1967～)男，黑龍江綏化人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: 370786436@ qq.com。

作者簡介:朱金玲(1967～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

基金項目:①1.黑龍江省自然科學(xué)基金資助，編號: H201369; 2.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究重點項目，編號: Sz2013－001。

中圖分類號:R979.1

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0001－02