大黃游離蒽醌對重癥急性胰腺炎大鼠腸道免疫功能的影響及其作用機制

陳立，范玲，譚小勇，王璐璐，劉媛琪，熊玉霞

(四川醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州646000)

大黃游離蒽醌對重癥急性胰腺炎大鼠腸道免疫功能的影響及其作用機制

陳立，范玲，譚小勇，王璐璐，劉媛琪，熊玉霞

(四川醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州646000)

目的 觀察大黃游離蒽醌對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠腸道免疫功能的影響，并探討其作用機制。方法 將24只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、大黃游離蒽醌組及生大黃水煎液組，每組6只。模型組、大黃游離蒽醌組及生大黃水煎液組經(jīng)胰膽管逆行注射?；悄懰徕c制作SAP模型，假手術(shù)組經(jīng)胰膽管逆行注射等量滅菌生理鹽水。大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組建模前12 h及建模2 h分別給予大黃游離蒽醌200 mg/kg和生大黃水煎液6.6 g/kg灌胃，假手術(shù)組、模型組不予處理。建模24 h，取各組腸系膜淋巴結(jié)(MLN)，采用HE染色法觀察MLN組織病理形態(tài)變化，ELISA法檢測MLN組織勻漿上清液TNF-α、IL-1，免疫熒光法檢測核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣模式識別受體(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)表達，流式細胞儀檢測CD4+、CD4+CD25+Foxp3+細胞及Th1、Th2細胞數(shù)量，計算Treg比例、Th1/Th2。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組淋巴小結(jié)增大，皮質(zhì)區(qū)增厚，皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)數(shù)量增加；與模型組比較，大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)數(shù)量少、體積??；大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組淋巴小結(jié)大小相當(dāng)。TNF-α、IL-1和NLRP3、ASC水平：模型組明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，游離蒽醌組及生大黃組明顯低于模型組(P<0.05)。CD4+CD25+Foxp3+、CD4+、Treg比例：模型組明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，除大黃游黃蒽醌組CD4+外，大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組均明顯低于模型組(P均<0.05)。Th1、Th2及Th1/Th2：模型組Th1、Th1/Th2均高于假手術(shù)組(P均<0.05)，Th2低于假手術(shù)組(P<0.05)；大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組Th1、Th1/Th2較模型組均明顯降低(P均<0.05)，而Th2較模型組明顯升高(P<0.05)。大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組上述各檢測指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 大黃游離蒽醌能減輕SAP大鼠腸道的免疫炎性反應(yīng)，其效果與生大黃水煎液相當(dāng)；其機制可能是通過抑制炎性小體的表達和調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，干預(yù)SAP早期的免疫過激反應(yīng)，繼而調(diào)節(jié)機體的免疫平衡。

急性胰腺炎；腸道免疫；大黃游離蒽醌；大鼠

重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病機制復(fù)雜，病情兇險，可引發(fā)多器官功能衰竭[1]。腸道是SAP發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的中心器官，炎性細胞因子“瀑布樣”釋放是病情加劇的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前對炎性細胞因子調(diào)控的研究多集中于腸黏膜免疫，對腸黏膜周圍免疫器官——腸系膜淋巴結(jié)(MLN)免疫功能狀態(tài)及其對炎性細胞因子調(diào)控的研究較少。大黃及其復(fù)方制劑治療SAP已得到廣泛認(rèn)可，但由于其成分復(fù)雜、口感差、用量大且無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)等使其臨床應(yīng)用受到限制[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃游離蒽醌對SAP所致的多器官損傷具有一定治療作用，但其能否改善SAP患者MLN免疫功能狀態(tài)尚不明確。2014～2015年，我們觀察了大黃游離蒽醌對SAP大鼠腸道免疫功能的影響，旨在為其臨床治療SAP提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級、雄性SD大鼠24只，6周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由四川醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(川)2013-17。VERSE流式細胞儀，美國BD公司；EVOS fl無目鏡熒光倒置顯微鏡，美國Life Technologies公司；伯樂680酶標(biāo)檢測儀，美國Bio-Rad公司。大黃游離蒽醌，淮安市巍偉植化研究所，游離蒽醌含量≥50%；抗大鼠APC-CD4、PE-CD25、FITC-Foxp3、FITC-IFN-γ、PE-IL-4抗體，美國BioLegend公司；牛膽酸鈉，美國Sigma公司；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣模式識別受體(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)抗體，美國Santa Cruz公司；FITC-抗兔IgG、TRITC-抗山羊IgG抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-1試劑盒，美國RD公司。

1.2 模型制備及干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，試驗前禁食12 h、不禁水。隨機將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組，每組6只。模型組、大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組經(jīng)胰膽管逆行注射?；悄懰徕c制作SAP模型。大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組建模前12 h及建模2 h分別給予大黃游離蒽醌200 mg/kg和生大黃水煎液6.6 g/kg灌胃。假手術(shù)組經(jīng)胰膽管逆行注射等量滅菌生理鹽水。假手術(shù)組、模型組不予任何處理。各組建模24 h開腹采集MLN組織。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 MLN組織病理形態(tài) 各組均取部分MLN組織，10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚切片，脫蠟，HE染色。光鏡下觀察MLN組織病理形態(tài)變化。

1.3.2 MLN組織勻漿上清液TNF-α、IL-1 取MLN組織約0.2 g，按質(zhì)量/容積1∶10加入冰生理鹽水，冰上充分勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液，制成10%組織勻漿。采用ELISA法檢測勻漿上清液TNF-α、IL-1。

1.3.3 MLN組織NLRP3和ASC表達 采用免疫熒光法。取MLN組織切片，65 ℃烘片2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，3% H2O2去內(nèi)源性酶。將切片置于枸櫞酸溶液中高溫修復(fù)，自然冷卻至室溫，滴加0.3% TritonX-100打孔，5% BSA封閉。滴加一抗，4 ℃過夜。次日復(fù)溫，滴加熒光二抗，37 ℃避光孵育，甘油封片，上機拍照。NLRP3陽性表達呈綠色，ASC陽性表達呈紅色。光鏡(×400)下每張切片選取10個視野，計數(shù)NLRP3、ASC陽性細胞數(shù)量。

1.3.4 MLN組織 Treg細胞比例 采用流式細胞儀檢測。取MLN組織約0.2 g，制備單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清。加入完全培養(yǎng)基重懸MLN細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，置于1.5 mL離心管中，每管100 μL；分別對應(yīng)加入5 μL CD4抗體和5 μL CD25抗體，避光孵育20 min，PBS重懸，離心去上清，破膜液重懸；分別加入Foxp3抗體5 μL，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次，加300 μL PBS混勻，上機檢測。選定CD4+T細胞群，將CD4+CD25+Foxp3+標(biāo)記為陽性細胞，以CD4+CD25+Foxp3+細胞占CD4+T細胞的比例作為Treg比例。

1.3.5 MLN組織Th1、Th2及Th1/Th2 采用流式細胞儀檢測。取MLN組織約0.2 g，制備單細胞懸液，置于2個1.5 mL離心管中，每管100 μL；每管加入2 μL莫能霉素，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育5 h，350 g離心5 min，去上清；加入2 mL PBS，350 g離心5 min，去上清。分別加入相應(yīng)的表面標(biāo)記抗體CD4 5 μL，混勻，室溫避光孵育15 min。PBS重懸，離心去上清。固定液固定，混勻，室溫避光孵育，離心去上清。PBS重懸，4 ℃避光保存。次日離心去上清。破膜液重懸，離心去上清。分別加入5 μL IL-4和20 μL IFN-γ，避光室溫孵育20 min。用PBS洗滌2次，離心去上清。PBS重懸后上機檢測。選定CD4+T細胞群，以CD4+IFN-γ+和CD4+IL-4+分別表示Th1和Th2細胞，二者比值即為Th1/Th2。

2 結(jié)果

2.1 各組MLN組織病理形態(tài)變化 與假手術(shù)組比較，模型組淋巴小結(jié)增大，皮質(zhì)區(qū)增厚，皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)數(shù)量增加。與模型組比較，大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)數(shù)量少、體積小。大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組淋巴小結(jié)大小相當(dāng)，但大黃游離蒽醌組淋巴小結(jié)數(shù)量稍多。

2.2 各組MLN組織勻漿上清液TNF-α、IL-1水平比較 見表1。

2.3 各組NLRP3、ASC表達比較 免疫熒光顯示，NLRP3陽性表達定位于細胞質(zhì)，且大部分與ASC陽性表達具有共定位。假手術(shù)組NLRP3、ASC幾乎無陽性表達，模型組NLRP3、ASC呈陽性表達，大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組二者陽性表達較模型組明顯減弱。各組MLN組織ASC、NLRP3陽性細胞數(shù)量比較見表2。

表1 各組MLN組織勻漿上清液IL-1、TNF-α水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組較，#P<0.05。

表2 各組MLN組織ASC、NLRP3陽性細胞數(shù)量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組較，#P<0.05。

2.4 各組CD4+CD25+Foxp3+、CD4+及Treg比例比較 見表3。

表3 各組MLN組織CD4+CD25+Foxp3+、CD4+及Treg比例比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.5 各組Th1、Th2及Th1/Th2比較 見表4。

表4 各組MLN組織Th1、Th2及Th1/Th2比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組較，#P<0.05。

3 討論

SAP的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，免疫細胞過度激活-炎性因子過度釋放是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。腸道淋巴免疫系統(tǒng)在SAP的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。TNF-α、IL-1是固有免疫中巨噬細胞分泌的炎性因子，在SAP初期即明顯升高[4，5]。TNF-α可使毛細血管通透性增加，誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致局部缺血壞死；IL-1的主要作用是誘導(dǎo)黏附分子分泌，激活中性粒細胞并使其黏附、脫顆粒，釋放氧自由基及蛋白水解酶[6]。NLRP3炎性復(fù)合體為固有免疫的重要組成部分，主要存在于細胞內(nèi)。該復(fù)合體由NLRP3、ASC和caspase-1組成，ASC是NLRP3與caspase-1的橋梁，參與caspase-1的活化；caspase-1能將IL-1β的前體裂解為IL-1β，使其活化并分泌。當(dāng)IL-1β分泌到細胞外，與IL-1受體結(jié)合，可引起炎癥反應(yīng)。如NLRP3炎性復(fù)合體調(diào)控失衡，可誘發(fā)一系列“瀑布樣”炎性反應(yīng)，對機體造成嚴(yán)重傷害[7]。有研究表明，缺乏ASC和NLRP3的胰腺炎模型大鼠胰腺水腫和炎癥反應(yīng)明顯減輕[8，9]。在特異性免疫中，SAP初期患者體內(nèi)Th1分泌大量的促炎性因子，導(dǎo)致Th1/Th2動態(tài)失衡，產(chǎn)生一系列“瀑布樣”炎癥反應(yīng)，加重組織細胞損傷，使SAP患者出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征等[10]。此時，IFN-γ分泌達到高峰，Treg細胞開始活躍，通過抑制INF-γ分泌、促進IL-4分泌抵抗過度的炎性反應(yīng)，發(fā)揮免疫抑制作用[11]。Treg細胞是CD4+T細胞亞群之一，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是目前發(fā)現(xiàn)最具特異性的Treg細胞內(nèi)標(biāo)志物。脂多糖能與Treg細胞內(nèi)選擇性高表達的TLR4受體結(jié)合，進而增強Treg細胞的增殖和生存能力，提高Treg細胞的免疫抑制功能[12]。熊澤翼等[13]研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠外周血Treg細胞顯著增加，胰腺病理評分顯著升高，提示Treg細胞對SAP大鼠的免疫功能有重要影響。因此，Treg細胞比例增加、Th1/Th2失衡都被認(rèn)為是腸道免疫失衡的表現(xiàn)。

目前中西結(jié)合治療SAP已被廣泛認(rèn)可，其中大黃是最常用的中藥。大黃游離蒽醌是大黃的主要活性成分，其成分有大黃素、大黃酸、大黃酚等，具有清熱解毒、抗菌消炎等作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃游離蒽醌進入體內(nèi)后各成分含量在正常大鼠胰腺組織與其他組織器官存在一定差異，但并不明顯，而在SAP大鼠胰腺組織中大黃素、大黃酸等含量明顯高于其他組織器官，說明大黃素、大黃酸等大黃游離蒽醌在SAP大鼠胰腺組織具有靶向分布的特點[15]。動物研究發(fā)現(xiàn)，大黃游離蒽醌對機體炎癥反應(yīng)和腸黏膜上皮細胞損傷的抑制以及對腸道微循環(huán)功能的改善作用是其保護犬SAP早期腸道損傷的重要機制[16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃游離蒽醌對SAP大鼠肺、腎等多器官損傷同樣具有較好的保護作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組、大黃游離蒽醌組、生大黃水煎液組TNF-α、IL-1和NLRP3均明顯高于假手術(shù)組，提示SAP早期固有免疫的過度激活能夠破壞腸道免疫平衡，產(chǎn)生過度的炎性反應(yīng)。大黃游離蒽醌和生大黃水煎液干預(yù)后上述指標(biāo)較模型組明顯降低，說明大黃游離蒽醌和生大黃水煎液對SAP大鼠腸道固有免疫具有一定調(diào)節(jié)作用。本研究造模早期Th1/Th2嚴(yán)重失衡，Treg細胞比例增加，而在大黃游離蒽醌和生大黃水煎液干預(yù)后，Treg細胞比例有所降低，Th1/Th2失衡有所改善，說明在大黃游離蒽醌和生大黃水煎液對SAP大鼠腸道特異性免疫也有一定調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，大黃游離蒽醌、生大黃水煎液均能通過抑制SAP大鼠早期過激的免疫反應(yīng)發(fā)揮作用，在一定程度上減輕SAP所致的多器官功能損傷，且兩者對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用相當(dāng)。而大黃游離蒽醌具有成分相對清楚、質(zhì)量可控和用量小等優(yōu)點。本研究為大黃游離蒽醌的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Effects of free anthraquinone of rhubarb on immune function of mesenteric lymph nodes in rats with severe acute pancreatitis

CHENLi,FANLing,TANXiaoyong,WANGLulu,LIUYuanqi,XIONGYuxia

(DepartmentofParmacology,SichuanMedicaluniversity,Luzhou, 646000)

Objective To observe the effects of free anthraquinones of rhubarb on immune function in mesenteric lymph nodes (MLN) of severe acute pancreatitis (SAP) rats. Methods Twenty-four healthy male SD rats were randomly divided into the sham operation group, model group, free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decoction group, 6 rats in each group. SAP model was made by retrograde pancreatic duct injection of sodium taurocholate in the model group, free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decoction group. The sham operation group was injected with equal volume of sterilized normal saline by retrograde injection of pancreatic duct. Rhubarb decoction group and free rhubarb anthraquinone group were respectively administrated by intragastric administration with 200 mg/kg free anthraquinone of rhubarb and 6.6 g/kg rhubarb decoction at 12 hours before and 2 hours after the inducement of SAP. Sham operation group and model group were not treated. MLN was collected 24 hours after molding. The histopathological changes of MLN were observed under light microscope after HE staining. The levels of TNF-α and IL-1 in MLN homogenate were detected by ELISA. The expression of NLRP3 and ASC was tested in the MLN by immunoflurescence. The number of CD4+, CD4+CD25+Foxp3+, Th1, Th2, Th1/Th2 ratio and Treg percentage were tested by flow cytometry. Results Lymphoid nodules appeared to be enlarged, cortex was thickened, the quantity of lymphoid nodules was increased in the cortex area of the model group as compared with those of the sham operation group. The quantity and size of lymphoid nodules in the cortex area were smaller in free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decoction group than that of the model group. No difference was found in the lymph nodule volume between the free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decoction group. Expression level of NLRP3, IL-1 and TNF-α: the model group was significantly higher than the sham operation group (P<0.05), the free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decoction group was significantly lower than the model group (P<0.05). CD4+CD25+Foxp3+, CD4+and Treg ratio: the model group was significantly higher than the sham operation group (P<0.05), except for CD4+in the free rhubarb anthraquinone group, the free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decoction group was significantly lower than the model group (allP<0.05). Th1, Th2 and Th1/Th2: Compared with the sham operation group, Th1 and Th1/Th2 was higher, and the Th2 in the model group was significantly lower (allP<0.05). Th1 and Th1/Th2 was significantly lower in the free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decation group than in the model group, and the Th2 in free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decoction group was significantly higher than that of the model group (P<0.05). No statistically significant difference was found in the above indicators between the free rhubarb anthraquinone group and rhubarb decoction group (allP>0.05). Conclusions Free anthraquinone of rhubarb can significantly reduce immune inflammatory response in intestine, and its effect is similar to rhubarb decoction. The mechanism may be that free anthraquinone of rhubarb may regulate the body′s immune balance through inhibiting the expression of inflammasome, regulating Th1/Th2 imbalance and intervening the immune response in early stage of acute pancreatitis.

severe acute pancreatitis; intestinal immune; free anthraquinone of rhubarb; rats

國家自然科學(xué)基金資助項目(81102868)。

陳立(1986-)，男，碩士在讀，研究方向為抗炎免疫藥理。E-mail： 153619478@qq.com

熊玉霞(1975-)，女，副教授，研究方向為抗炎免疫藥理，多次主持國家級、省部級科研課題。E-mail： xyx_cell@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.004

R285.5

A

1002-266X(2016)24-0013-04

2015-12-08)