絕經后骨質疏松癥患者骨組織JMJD2A、JMJD2B表達變化及意義

郭承，張穎，唐宏宇，董路玨，周馳，霍少川，劉勇，劉又文，王海彬

(1廣州中醫(yī)藥大學，廣州510405；2河南省洛陽正骨醫(yī)院；3廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

絕經后骨質疏松癥患者骨組織JMJD2A、JMJD2B表達變化及意義

郭承1，張穎2，唐宏宇3，董路玨1，周馳3，霍少川1，劉勇1，劉又文2，王海彬3

(1廣州中醫(yī)藥大學，廣州510405；2河南省洛陽正骨醫(yī)院；3廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

目的 觀察絕經后骨質疏松癥(PMOP)患者骨組織組蛋白去甲基化酶JMJD2表達變化，并分析其與骨密度(BMD)的關系。方法 選擇擬行全髖關節(jié)置換術的絕經后患者30 例，術前根據股骨頸BMD分為骨質疏松組15例和骨量正常組15例。術中取術側股骨頸松質骨，采用實時定量PCR法和免疫組化法分別檢測骨組織中JMJD2A和JMJD2B mRNA和蛋白表達，并分析其與BMD的關系。結果 與骨量正常組比較，骨質疏松組JMJD2A、JMJD2B mRNA相對表達量和蛋白陽性率均顯著降低(P均<0.01)。直線相關分析結果顯示，BMD與JMJD2A、JMJD2B mRNA相對表達量均呈正相關(r分別為0.705，0.796，P均<0.01)BMD與JMJD2A、JMJD2B蛋白表達陽性率均呈正相關(r分別為0.606、0.674，P均<0.01)。結論 PMOP患者骨組織JMJD2A和JMJD2B表達均降低，二者可能共同參與了PMOP的發(fā)病過程。

骨質疏松癥；骨組織；組蛋白去甲基化酶；骨密度

絕經后骨質疏松癥(PMOP)是以絕經后出現(xiàn)骨轉換率增快，骨量減少，骨組織微細結構破壞，骨強度降低為特征的一種全身性代謝性骨病，而絕經后卵巢功能衰退引起雌激素水平降低是其發(fā)病的主要原因[1]。女性絕經后體內雌激素受體(ER)蛋白表達降低、功能減退，提示ER與PMOP的發(fā)生密切相關，而ER基因啟動子甲基化會抑制蛋白表達，從而影響骨形成和成骨細胞分化[2～4]。盡管最初組蛋白甲基化被認為是一種穩(wěn)定狀態(tài)的修飾，但隨著對甲基化的深入研究，尤其是組蛋白去甲基化酶JMJD2的發(fā)現(xiàn)， 人們認識到組蛋白甲基化修飾存在甲基化和去甲基化的動態(tài)調節(jié)過程，同時這種動態(tài)調節(jié)對基因表達及下游效應的發(fā)生起著至關重要的作用[5～7]。目前關于JMJD2蛋白家族是否與PMOP患者的異常骨代謝有關的報道較少。為此，我們觀察了PMOP患者骨組織JMJD2A、JMJD2B的表達變化，并探討其與骨密度(BMD)的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年10月～2015年6月廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院收治、因髖關節(jié)骨性關節(jié)炎擬行全髖關節(jié)置換術的絕經后患者30例。納入標準：①年齡50～70歲；②自然絕經，停經1年以上。排除標準：①合并嚴重心腦血管疾病、糖尿病以及肝腎功能不全者；②合并甲狀腺功能亢進、類風濕性關節(jié)炎等可引起繼發(fā)性骨質疏松癥者； ③有糖皮質類激素應用史者；④半年內服用可能影響骨代謝藥物者。患者術前采用法國MEDILINK公司雙能X線骨密度儀測量術側股骨頸BMD，分為骨質疏松組15例(T值<-2.5)和骨量正常組15例(T值>-1.0)。骨質疏松組年齡55～70歲、中位年齡61.4歲，BMI 23.88±2.06，股骨頸BMD(0.72±0.05)g/cm2；骨量正常組年齡50～67歲、中位年齡59.3歲，BMI 24.41±3.14，股骨頸BMD(1.02±0.09)g/cm2。兩組年齡、BMI具有可比性。本研究通過廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查，所有患者簽署書面知情同意書。

1.2 標本采集方法 兩組均行全髖關節(jié)置換術，術中采用無菌咬骨鉗咬取股骨頸處松質骨，放入凍存管中，立即放入小型液氮罐中，送至-80 ℃冰箱保存，用于實時定量PCR檢測。同時咬取體積約為1 cm×1 cm×0.5 cm的松質骨，放入10%甲醛溶液中固定，用于免疫組化檢測。

1.3 骨組織JMJD2A、JMJD2B mRNA表達檢測 采用實時定量PCR法。取液氮保存的松質骨，采用 King FisherDuo全自動磁珠純化提取儀(Thermo公司)提取總RNA，全波長酶標儀(Thermo公司)檢測總RNA樣品的純度，OD260/OD280控制在1.85～2.00，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。以總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa公司)說明書逆轉錄成cDNA。從GeneBank中獲取基因序列，由上海英濰捷基有限公司采用Primer Premier 5.0軟件設計合成PCR引物，以β-action為內參，引物序列及長度見表1。根據SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(TaKaRa公司)說明書，采用兩步法PCR擴增反應程序進行檢測。CFX96TMRT-PCR儀(BIO-RAD公司)進行實時定量PCR擴增反應，反應體系25 μL：2×SYBR?Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2.5 μL，去離子水8 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。根據標準曲線顯示目標基因和內參基因擴增效率均接近100%，且相互間效率偏差在5%以內。目的基因相對表達量以2-ΔΔCT表示。

表1 基因引物序列及長度

1.4 骨組織JMJD2A、JMJD2B蛋白表達檢測 采用免疫組化法。將放入10%甲醛溶液的松質骨常溫下進行固定，PLANK脫鈣液脫鈣2～3天，期間換脫鈣液1次。脫鈣完成后用自來水流水沖洗12 h，再進行梯度乙醇脫水、TO透明劑透明、浸蠟，石蠟包埋。病理切片機對石蠟標本進行4 μm厚度切片，將蠟片展于標記的防脫載玻片上，60 ℃烤箱烤片2 h。經脫蠟，抗原修復，封閉，一抗、二抗(CST公司)孵育，DAB顯色；蘇木素復染，脫水，封片。200倍熒光倒置相差顯微鏡(Leica公司)下，每張切片隨機選取5個視野，觀察染色情況。JMJD2A、JMJD2B蛋白陽性表達均定位于細胞核，染色程度評分：陰性著色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分；陽性細胞百分比評分：0～10%計1分、11%～50%計2分、51%～80%3分、>80%計4分。兩評分相乘得0為陰性，1～4為弱陽性，>4為強陽性。弱陽性和強陽性均視為陽性，計算陽性率。

2 結果

2.1 兩組骨組織JMJD2A、JMJD2B mRNA表達比較 與骨量正常組相比，骨質疏松組JMJD2A、JMJD2B mRNA相對表達量均顯著明顯下降(P均<0.01)。見表2。

表2 兩組骨組織JMJD2A、JMJD2B mRNA表達比較(相對表達量

注：與骨量正常組比較，*P<0.01。

2.2 兩組骨組織JMJD2A、JMJD2B蛋白表達比較 骨質疏松組JMJD2A、JMJD2B蛋白陽性率分別為13.3%、26.7%，骨量正常組分別為66.7%、86.7%；骨質疏松組JMJD2A、JMJD2B蛋白陽性率均低于骨量正常組(P均<0.01)。

2.3 BMD與JMJD2A、JMJD2B表達的關系 直線相關分析結果顯示，BMD與JMJD2A、JMJD2B mRNA相對表達量均呈正相關(r分別為0.705、0.796，P均<0.01)，與其蛋白表達陽性率均呈正相關(r分別為0.606、0.674，P均<0.01)。校正年齡和BMI后采用偏相關分析結果顯示，BMD與JMJD2A、JMJD2B mRNA相對表達量均呈正相關(r分別為0.717、0.787，P均<0.01)，與其蛋白表達陽性率均呈正相關(r分別為0.571、0.658，P均<0.01)。

3 討論

組蛋白甲基化是表觀遺傳中重要的修飾方式之一，對基因表達的影響具有位點特異性[8]，主要發(fā)生在組蛋白H3或H4的賴氨酸和精氨酸殘基上，又以H3的賴氨酸甲基化最常見，其K4、K9、K27、K36和H4的K20等位點均可被甲基化，且這些位置的賴氨酸殘基不僅有單甲基化修飾，還有二甲基化和三甲基化修飾[9]。組蛋白去甲基化酶JMJD2蛋白家族的蛋白序列中均含有組蛋白去甲基化酶標志性結構域Jumonji C(JmjC)，除了JmjC結構域之外，這些蛋白質還包含JmJN、PHD和Tudor結構域。JmjC 區(qū)域通過氧化反應能催化單、雙和三甲基化的賴氨酸殘基發(fā)生去甲基化，從而發(fā)揮生物學功能[7]。研究表明，JMJD2 蛋白可以使雙核三甲基化的組蛋白H3蛋白Lys9和Lys36位點去甲基化，且具有轉錄激活和抑制因子的功能[10,11]。

研究證實，JMJD2A和JMJD2B均可以作為ER的共激活因子而發(fā)揮作用[12]。JMJD2A可通過激活ER而促進乳腺癌細胞的增殖；而JMJD2B的表達不僅受到ER和雌激素的調控，還可以與H3的K4位點甲基化酶MLL2結合形成復合物，作為ER的共激活因子發(fā)揮功能。JMJD2B首先將ER靶基因啟動子H3K9me3去甲基化，之后MLL2啟動H3的K4位點甲基化，增加ER靶基因的表達，從而發(fā)揮作用[13,14]。因此，我們推測JMJD2A和JMJD2B可能通過雌激素-ER信號通路調節(jié)骨代謝和BMD。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與骨量正常組相比，骨質疏松組JMJD2A、JMJD2B mRNA相對表達量和蛋白陽性率均顯著下降；相關性分析顯示BMD與JMJD2A、JMJD2B表達均呈正相關。

綜上所述，PMOP患者骨組織JMJD2A和JMJD2B表達均降低，并與BMD降低有關，二者可能參與了PMOP的發(fā)病過程。本研究為進一步研究PMOP的發(fā)病機制提供了依據，但JMJD2A和JMJD2B在骨代謝中的功能和調控機制尚不清楚，仍需進一步研究。

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國家自然科學基金資助項目(81373655)；廣東省科技廳項目(2013B021800226)。

王海彬(E-mail: hipman@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.012

R580

B

1002-266X(2016)16-0037-03

2015-11-03)