大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的建立及意義

軒亞茹，張春春，王亞華，彭曦，閆荷露，李霞，應(yīng)雪，唐輝

(1新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832000；2新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的建立及意義

軒亞茹1，張春春1，王亞華1，彭曦2，閆荷露1，李霞1，應(yīng)雪1，唐輝1

(1新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832000；2新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

目的 建立穩(wěn)定可靠、簡便易行的大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，為深入研究腦膠質(zhì)瘤提供理想的動物模型。方法 選擇24只大鼠作為模型組，采用立體定向儀，將1×106個/10 μL的C6腦膠質(zhì)瘤細胞懸液接種于大鼠大腦右側(cè)尾狀核區(qū)，建立腦膠質(zhì)瘤動物模型。選擇6只大鼠作為正常組，顱內(nèi)鉆孔后不接種C6腦膠質(zhì)瘤細胞。模型組隨機選擇6只，比較兩組生長狀況、活動飲食情況及體質(zhì)量變化。模型組剩余大鼠分別于建模第7、14、21天各隨機處死6只，病理解剖觀察腫瘤體積變化及臟器轉(zhuǎn)移情況；取模型組建模第7天的腦組織，正常組同期處死，取腦組織行HE染色，觀察腫瘤組織病理學(xué)變化。結(jié)果 正常組生長狀況良好，活動飲食均正常，體質(zhì)量逐漸升高。模型組荷瘤后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、食欲不振、腹瀉、出血甚至死亡，體質(zhì)量逐漸下降。與建模第7天比較，建模第14、21天腫瘤體積體明顯增大(P均<0.05)，且建模第21天腫瘤體積明顯大于建模第14天(P<0.05)。模型組腦組織HE染色后可見腫瘤細胞呈紡錘形，核大深染，核分裂相多見，生長活躍，密集成群，排列紊亂；正常組腦組織HE染色后可見細胞分布均勻，無異?，F(xiàn)象。結(jié)論 成功建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型；該模型成瘤周期短，腫瘤細胞生長穩(wěn)定，可為腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究提供理想的動物模型。

腦膠質(zhì)瘤；立體定向；病理特征；大鼠

腦膠質(zhì)瘤惡性程度高，患者平均生存時間僅14.6個月，5年生存率不超過5%[1，2]。腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，手術(shù)難以完全切除，且對放射治療不敏感[3]；由于血腦屏障的存在，大部分化療藥物無法到達病灶部位[4]。多數(shù)患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率較高。為研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制，必須建立一種穩(wěn)定、良好的腦膠質(zhì)瘤動物模型。2015年4～5月，我們建立了一種大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型，并對該模型進行評價?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自新疆地方病防治研究所，動物許可證號：SXSK(新)-20150001。C6膠質(zhì)瘤細胞株，中國科學(xué)院上海細胞庫。CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；臺式離心機，美國貝克曼庫爾特公司；電子恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；腦立體定向儀，深圳市瑞沃德生命科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶，美國Gibco公司；FBS，杭州四季青生物科技有限公司；青霉素與鏈霉素混合液，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖溶液，上海生工生物工程科技有限公司；骨蠟，上海三友醫(yī)療器械有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 取C6腦膠質(zhì)瘤細胞2×106個，置于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h，細胞融合80%時，加入0.25%胰蛋白酶消化。倒置顯微鏡下觀察到細胞回縮變圓時，加入完全培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min離心3 min，收集細胞，用無血清培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，采用血球計數(shù)板計數(shù)，將單細胞懸液密度調(diào)整為1×106個/10 μL，置于37 ℃恒溫振蕩水浴中存放待用。

1.3 動物模型制備 隨機選取24只大鼠(模型組)，禁食12 h、不禁水，采用20%氨基甲酸乙酯1 g/kg腹腔注射麻醉，并固定于腦立體定向儀上，兩耳針深入外耳道對稱固定。顱頂備皮，75%乙醇消毒后鋪洞巾，沿正中矢狀線，縱向切開頭皮約1.5 cm，分離暴露顱骨。根據(jù)大鼠頭部解剖圖譜確定前囟中點前0.4 mm，中線右側(cè)3.0 mm，牙科鉆鉆孔。用10 μL微量注射器抽吸10 μL單細胞懸液，沿骨孔緩慢垂直進針至硬腦膜下6.0 mm，退針1 mm后固定。緩慢注射10 min(1 μL/min)，注射完畢后留針5 min，緩慢拔針，骨蠟封閉骨窗。縫合切口后消毒皮膚，肌注青霉素1萬U。剩余6只大鼠作為正常組，顱內(nèi)鉆孔后不接種C6腦膠質(zhì)瘤細胞。所有大鼠常規(guī)單籠飼養(yǎng)[5～7]。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察 ①基本情況：模型組隨機取6只，觀察兩組生長狀況、飲食活動情況，以及建模第0、7、14、21天體質(zhì)量變化。②病理解剖學(xué)檢查：模型組剩余大鼠分別于建模第7、14、21天各隨機處死6只，4% PBS多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定后獲取大鼠全腦標(biāo)本，取心、肝、脾、肺、腎、脊髓等主要臟器，檢查有無臟器轉(zhuǎn)移灶。大鼠在處死后或自然死亡時，獲取全腦標(biāo)本。按腦表面的接種穿刺點作一冠狀交叉切口，觀察腫瘤生長情況，計算腫瘤體積=a×b×c(a為腫瘤的最大徑，b為與最大徑垂直的最寬徑，c為腫瘤的高)[8]。③組織病理學(xué)檢查：取模型組建模第7天的腦組織，正常組同期處死，取腦組織進行固定，脫水；常規(guī)石蠟切片，片厚4 μm，HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本情況觀察結(jié)果 正常組生長狀況良好，活動、飲食均正常。模型組接種第2天開始，大鼠活動基本正常，少量進食，頭部手術(shù)切口均無感染，大部分大鼠眼周有出血癥狀；接種7天開始，大鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、食欲不振、腹瀉；接種第14天開始，上述癥狀明顯加重，皮毛失去光澤，眼周淤血，進食量明顯減少，體質(zhì)量下降，部分出現(xiàn)偏癱、昏迷，甚至死亡。兩組體質(zhì)量變化見表1。

表1 兩組體質(zhì)量變化

注：與正常組同期比較，*P<0.05；與同組0天比較，#P<0.05；與同組7天比較，△P<0.05；與同組14天比較，▲P<0.05。

2.2 腫瘤的病理解剖觀察結(jié)果及其體積變化 模型組肉眼可見腫瘤呈浸潤性生長，較周圍正常組織顏色深，切面可見腫瘤內(nèi)出血和組織壞死。未見其他臟器轉(zhuǎn)移。接種第7、14、21天，腫瘤體積分別為(5.38±1.32)、(41.57±9.68)、(155.48±31.96)mm3。與建模第7天比較，建模第14、21天腫瘤體積明顯增大(P均<0.05)，且建模第21天腫瘤體積明顯大于建模第14天(P<0.05)。

2.3 腫瘤的組織病理學(xué)觀察結(jié)果 模型組腦組織HE染色后可見腫瘤細胞呈紡錘形，核大深染，核分裂相多見，生長活躍，密集成群，排列紊亂；正常組腦組織HE染色后可見細胞分布均勻，無異?，F(xiàn)象。腫瘤向腦組織呈浸潤性生長，與正常組織交界處仍能見到一個較明顯的界線；在正常組織內(nèi)散布多個腫瘤細胞簇，多呈橢圓形，圍繞血管快速分裂增殖，見插頁Ⅲ圖7。腫瘤組織內(nèi)有出血和壞死區(qū)域，伴有豐富的微血管，這些膨脹的微血管內(nèi)充斥著大量的紅細胞，并被壞死區(qū)域包圍。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤為常見的顱內(nèi)腫瘤，因其呈浸潤性生長，無明顯邊界，手術(shù)不能完全切除[9,10]，故臨床治愈率低，患者生存時間短、病死率高[11]。膠質(zhì)瘤是由于先天的遺傳高危因素和環(huán)境中的致癌因素相互作用所導(dǎo)致的，其發(fā)病機制目前仍不十分清楚。為了更詳細地了解腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制，尋找新的治療方法，建立可靠的腦膠質(zhì)瘤動物模型成為重中之重。

本研究選擇C6/Wistar模型，其中C6腦膠質(zhì)瘤細胞在各種大鼠中均有較好的組織相容性，在大鼠腦內(nèi)接種后腫瘤形成快，成活率較高；其生物學(xué)特性與人腦膠質(zhì)瘤較為接近，有浸潤性生長、新生血管形成的特性[12]，建立模型的瘤體特征及生長方式更接近于人腦惡性膠質(zhì)瘤[3]，呈現(xiàn)多形性、高有絲分裂指數(shù)、瘤內(nèi)局灶壞死出血和腦實質(zhì)浸潤的特點[13]，適合用來研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制和治療方法。

本研究將C6腦膠質(zhì)瘤細胞懸液置于37 ℃恒溫振蕩水浴中，可避免細胞死亡和沉積底部，造成細胞密度不均勻。在皮層接種腦膠質(zhì)瘤細胞時借助于立體定向儀對S1區(qū)進行準(zhǔn)確定位，確定進針深度為6 mm、退針深度為1 mm，創(chuàng)建一個細胞懸液暫時存儲空間，并防止其沿針道擴散；接種完畢后，留針5 min再緩慢拔針，防止細胞溢出，使細胞充分沉積，延長腫瘤細胞與靶點腦組織的接觸時間，從而提高成瘤率[7]；用生理鹽水沖洗術(shù)野、無菌骨蠟封閉骨窗，縫合切口；術(shù)后靜脈注射青霉素，有效防止動物模型術(shù)后感染，確保模型的成功率和標(biāo)準(zhǔn)化，有利于準(zhǔn)確評估實驗效果。

本研究結(jié)果顯示，模型組建模7天后可表現(xiàn)出進食減少、腹瀉、萎靡不振等明顯的癥狀，隨時間延長，癥狀逐漸加重；建模14天內(nèi)體質(zhì)量呈輕微的上升趨勢，之后呈下降趨勢，提示接種2周后，腫瘤的生長已嚴(yán)重影響大鼠的進食及活動；建模第21天后大多呈瀕死狀態(tài)，甚至死亡。本研究中，建模第14天腫瘤體積已達(41.57±9.68)mm3，建模第21天達到(155.48±31.96)mm3，結(jié)合大鼠體質(zhì)量變化，推測大鼠體質(zhì)量一旦開始下降，意味著腫瘤已進入快速生長階段。根據(jù)本研究動物模型腫瘤的生長特點，考慮本模型的治療時間為建模第14天左右。模型組大鼠大腦全腦標(biāo)本可見，形成的腦膠質(zhì)瘤大小和形狀相似，由于大腦右側(cè)腫瘤生長，導(dǎo)致腦中線向左偏，占位效應(yīng)明顯；左側(cè)正常的大腦皮層和紋狀體部分，顏色都較淺，側(cè)腦室明顯，而右側(cè)大腦部分可觀察到腫瘤組織顏色較深，在大腦尾狀核處向周圍腦組織浸潤，無包膜，腫瘤區(qū)有出血、壞死以及豐富的新生血管。HE染色顯示，C6/Wistar模型所形成的腦膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出明顯的侵襲性，腫瘤呈不定性生長，單個遷移的C6腦膠質(zhì)瘤細胞或C6腦膠質(zhì)瘤細胞簇分布在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[11]，本研究建立的動物模型結(jié)果與上述說法呈現(xiàn)一致性。大鼠腦內(nèi)的人異種移植腫瘤細胞和人腦內(nèi)的惡性膠質(zhì)瘤細胞同大多數(shù)腫瘤細胞一樣，通常沿著血管和神經(jīng)纖維周圍生長和遷移，C6腦膠質(zhì)瘤細胞傾向于圍繞血管生長，表現(xiàn)出親內(nèi)皮基底膜的性質(zhì)，提示C6腦膠質(zhì)瘤細胞生長、成瘤與內(nèi)皮細胞有緊密聯(lián)系[12，13]。

總之，本研究成功建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，該模型成瘤周期短，腫瘤細胞生長穩(wěn)定，可為腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究提供理想的動物模型。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.009

R739.4

A

1002-266X(2016)16-0030-03

2015-09-18)