慢病毒介導干擾LSD1基因的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構建及鑒定

萬曉蕾 ，賴文升，邵根寶，李袁霞，劉秀雯，金潔，吳朝陽

(1江蘇大學附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212002；2江蘇大學醫(yī)學院)

慢病毒介導干擾LSD1基因的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構建及鑒定

萬曉蕾1，2，賴文升2，邵根寶2，李袁霞2，劉秀雯2，金潔2，吳朝陽1

(1江蘇大學附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212002；2江蘇大學醫(yī)學院)

目的 構建并鑒定慢病毒介導干擾賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)基因的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，為深入研究以LSD1為靶點的表觀遺傳學抗腫瘤治療奠定基礎。方法 擴增并抽提所需質(zhì)粒，紫外分光光度計檢測質(zhì)粒純度，計算A260/A280。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人腎上皮細胞293T，取轉(zhuǎn)染THM質(zhì)粒后的293T細胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況；分別取轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒和PLKO空載體質(zhì)粒后的293T細胞，收集病毒上清液，感染人卵巢癌SKOV3細胞(分別記為觀察組和對照組)，篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。觀察組經(jīng)濃度梯度(0、1、10、100、1 000 ng/mL)多西環(huán)素誘導，以及兩組均經(jīng)100 ng/mL多西環(huán)素誘導后，采用Western blotting法檢測LSD1及其特異性反應底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量。結(jié)果 目的質(zhì)粒A260/A280在2.0左右，說明純度較高；THM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞呈綠色熒光，為真核載體表達的綠色熒光蛋白，表明成功轉(zhuǎn)染。隨著多西環(huán)素濃度的升高，觀察組誘導后LSD1蛋白相對表達量均逐漸降低，H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量逐漸升高，各濃度間比較有統(tǒng)計學差異(P均<0.01)。觀察組經(jīng)100 ng/mL多西環(huán)素誘導后LSD1蛋白相對表達量均明顯低于同組誘導前及對照組誘導后，H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量明顯高于同組誘導前及對照組誘導后(P均<0.01)。 結(jié)論 成功構建慢病毒干擾下調(diào)LSD1基因表達的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并經(jīng)不同濃度多西環(huán)素誘導鑒定；該細胞株可用于以LSD1為靶點的表觀遺傳學抗腫瘤治療研究。

賴氨酸特異性去甲基化酶1；RNA干擾；人卵巢癌SKOV3細胞；穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株

研究證實，細胞表觀遺傳學異常，如DNA甲基化、組蛋白修飾等在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[1，2]。賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶，特異性作用于組蛋白H3第4位賴氨酸位點，催化移除一甲基團和二甲基團[3，4]。LSD1不僅能夠抑制p53的生物學活性，還能抑制p53信號途徑的傳遞和由p53引起的細胞凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。2014年9月～2015年3月，本研究采用慢病毒介導構建LSD1基因干擾的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并進行鑒定，為深入研究以LSD1為靶點的表觀遺傳學抗腫瘤治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞系SKOV3、人腎上皮細胞系293T由江蘇大學基礎醫(yī)學研究所提供。質(zhì)粒PLKO空載體質(zhì)粒由美國普渡大學胡長登教授惠贈。脂質(zhì)體細胞轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美國)，一抗LSD1(Cell Signal Technology公司，美國)，α-tubulin、蛋白抽提試劑盒(Bioworld Technology公司，美國)，H3K4me1、 me2(Upstate Biotechnology公司，美國)，Histone H3 antibody (Abcam公司，美國)，HRP標記的羊抗兔二抗、HRP 標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research Laboratories公司，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng) SKOV3細胞和293T細胞均置于含10% FBS和抗生素(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況及培養(yǎng)液顏色換液，當培養(yǎng)瓶中細胞生長至80%融合時，用胰酶消化傳代1次，傳代時以含0.25%胰酶+0.02% EDTA的PBS消化。取對數(shù)生長期細胞用于以下研究。

1.3 慢病毒介導干擾LSD1基因的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構建

1.3.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴增與抽提 ①轉(zhuǎn)化：將1 μL PLKO空載體質(zhì)粒加入50 μL感受態(tài)細胞DH5α中，混勻后冰浴30 min，于42 ℃溫浴90 s，冰浴2 min。加入500 μL LB培養(yǎng)基復蘇感受態(tài)細胞，37 ℃溫箱中靜置1 h。取50 μL涂板于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱孵育12 h。②擴增、抽提質(zhì)粒：用接種環(huán)挑取大而圓的克隆菌落，接種于5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃條件下，220 r/min搖菌16 h以擴增質(zhì)粒。取1.5 mL菌液，于室溫下10 000 g/min離心1 min，收集菌體，倒盡或吸干培養(yǎng)基。在菌體沉淀中加入250 μL含RNase A的SolutionⅠ，混勻靜置2 min，加入250 μL Solution Ⅱ，立即溫和顛倒離心管5～10次。室溫靜置5 min，加入350 μL Solution Ⅲ，輕搖5～10次以充分混勻。13 000 g/min離心10 min，將上清全部小心移入吸附柱；10 000 g/min離心1 min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。向吸附柱中加入500 μL Buffer HB，10 000 g/min離心1 min，倒掉收集管中的液體；再加700 μL Wash Buffer，10 000 g/min離心1 min，倒掉收集管中的液體。13 000 g/min離心2 min后，將柱子放入新的EP管，加30 μL預熱好的Elution Buffer(67 ℃)，37 ℃孵育2 min，13 000 g/min離心1 min，獲得所需質(zhì)粒。采用瓊脂糖凝膠電泳法驗證本研究所用質(zhì)粒(shLSD1目的質(zhì)粒、PLKO空載體質(zhì)粒、1562包膜質(zhì)粒、1563包裹質(zhì)粒)，紫外分光光度計檢測各質(zhì)粒純度，計算A260/A280。

1.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的293T細胞接種于培養(yǎng)皿中，調(diào)整細胞密度為2.5×105個/mL；置于無抗生素且含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，次日觀察細胞生長至80%融合，換成DMEM單純培養(yǎng)基。分別取1562包膜質(zhì)粒1.5 μg、1563包裹質(zhì)粒0.5 μg、相關質(zhì)粒(PLKO空載體質(zhì)粒、shLSD1目的質(zhì)粒或用于檢測轉(zhuǎn)染效率的THM質(zhì)粒)2 μg稀釋于DMEM 250 μL中，將16 μL脂質(zhì)體LipofectamineTM2000稀釋于DMEM 250 μL，二者混合，室溫孵育25 min后加入到各組細胞培養(yǎng)皿。37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染THM質(zhì)粒的細胞置于倒置熒光顯微鏡下，觀察含綠色熒光信號的細胞，評估轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染PLKO空載體質(zhì)粒、shLSD1目的質(zhì)粒的細胞每24 h更換1次新鮮培養(yǎng)基，重復3次，收集病毒上清液，4 ℃保存。

1.3.3 病毒上清液感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選 取對數(shù)生長期SKOV3細胞接種于培養(yǎng)皿中，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL；置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，次日觀察細胞生長至60%融合。將細胞分為觀察組和對照組，分別取1.3.2中采集到的轉(zhuǎn)染PLKO空載體質(zhì)粒、shLSD1目的質(zhì)粒的細胞病毒上清液1 mL，加入含8 μg/mL聚凝胺的完全培養(yǎng)基中，每24 h感染1次靶細胞，重復感染2次。兩組經(jīng)病毒感染48 h后，更換含1 μg/mL嘌呤霉素+10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，將存活的細胞株傳代培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

1.4 慢病毒介導干擾LSD1基因的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株鑒定 ①觀察組經(jīng)不同濃度多西環(huán)素誘導鑒定：取對數(shù)生長期的觀察組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，經(jīng)濃度梯度(0、1、10、100、1 000 ng/mL)多西環(huán)素誘導24 h，提取細胞蛋白，以Tubulin及Histon管家蛋白為內(nèi)參，采用Western blotting法檢測LSD1及其特異性反應底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量，嚴格按照試劑盒說明書操作。②觀察組和對照組經(jīng)100 ng/mL多西環(huán)素誘導鑒定：取對數(shù)生長期的觀察組和對照組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，經(jīng)100 ng/mL多西環(huán)素誘導24 h，采用Western blotting法檢測兩組經(jīng)多西環(huán)素誘導前后LSD1及H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量。試驗重復3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒純度檢測及轉(zhuǎn)染情況 各質(zhì)粒A260/A280在2.0左右，說明純度較高；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，各質(zhì)粒條帶清晰，堿基量大小與預期相符(見圖1)。轉(zhuǎn)染THM質(zhì)粒的細胞在倒置熒光顯微鏡下呈綠色熒光，為真核載體表達的綠色熒光蛋白，表明已成功轉(zhuǎn)染。

2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株鑒定結(jié)果 ①隨著多西環(huán)素濃度的升高，觀察組誘導后LSD1蛋白相對表達量逐漸降低，其特異性反應底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量逐漸升高，多濃度間比較均有統(tǒng)計學差異(P均<0.01)，見表1。②對照組經(jīng)100 ng/mL多西環(huán)素誘導前后LSD1及H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量比較無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)；觀察組經(jīng)100 ng/mL多西環(huán)素誘導后LSD1蛋白相對表達量明顯低于同組誘導前及對照組誘導后，H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量明顯高于同組誘導前及對照組誘導后(P均<0.01)。見表2。

注：1為擴增sh-LSD1目的質(zhì)粒，2為擴增PLKO空載體質(zhì)粒；3為1562包膜質(zhì)粒，4為1563包裹質(zhì)粒。

圖1 各質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

多西環(huán)素濃度LSD1/TubulinH3K4me1/HistonH3K4me2/Histon0ng/mL1.167±0.0440.228±0.0240.207±0.0271ng/mL1.055±0.068*0.510±0.075*0.325±0.006*10ng/mL0.618±0.017*0.698±0.085*0.365±0.017*100ng/mL0.587±0.080*1.075±0.011*0.379±0.038*1000ng/mL0.447±0.024*1.077±0.009*0.449±0.084*

注：多組間比較，P均<0.01；與0 ng/mL多西環(huán)素比較，*P<0.01。

表2 兩組經(jīng)100 ng/mL多西環(huán)素誘導前后LSD1及H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量比較

注：與同組誘導前比較，*P<0.01；與對照組誘導后比較，#P<0.01。

3 討論

臨床對卵巢癌患者多采用手術切除聯(lián)合藥物化療的方式治療，但由于癌細胞耐藥性的產(chǎn)生，卵巢癌患者5年生存率僅為30%左右[6～8]。表觀遺傳學修飾是指在不改變DNA序列的情況下，改變核苷酸或染色體可逆性修飾調(diào)節(jié)基因的表達，主要包括DNA修飾和組蛋白修飾等。表觀遺傳學異常導致的疾病稱為表觀遺傳病，腫瘤也是表觀遺傳病中的一種[9]。LSD家族是一類黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的去甲基化酶，能夠去除組蛋白H3K4和 H3K9的單、雙甲基，從而得到單甲基或無甲基的H3K4和H3K9。LSD1 作為第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶，在多種腫瘤組織中表達升高，如卵巢腫瘤[10]、乳腺癌[11，12]、前列腺癌[13]等。研究表明，LSD1的表達上調(diào)與腫瘤的惡性行為呈正相關，可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，提示患者預后不良[14，15]。因此，LSD1可以作為表觀遺傳治療的一個潛在靶點，為癌癥治療藥物的開發(fā)提供新方向。

綠色熒光蛋白基因是目前使用最為廣泛的熒光基因，表達綠色熒光，具有較高的信噪比，且在細胞內(nèi)熒光轉(zhuǎn)換效率高，易檢測，便于在倒置熒光顯微鏡下直觀觀察[16]。本研究采用含綠色熒光蛋白的THM質(zhì)粒評估轉(zhuǎn)染情況，其在倒置熒光顯微鏡下呈綠色熒光，為真核載體表達的綠色熒光蛋白，表明已成功轉(zhuǎn)染，有利于下一步病毒包裝、細胞感染。慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率較高，可在轉(zhuǎn)染的細胞中傳播穩(wěn)定的DNA片段，并實現(xiàn)穩(wěn)定表達，近年來應用日益廣泛。因此本研究采用慢病毒進行質(zhì)粒的包裝，獲得了高滴度的慢病毒載體；收集高滴度攜帶shLSD1基因的病毒上清液后，成功轉(zhuǎn)染了SKOV3細胞，并獲得持續(xù)穩(wěn)定表達。本研究結(jié)果顯示，隨著多西環(huán)素濃度升高，觀察組誘導后LSD1蛋白相對表達量逐漸降低，其特異性反應底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量逐漸升高，表明多西環(huán)素成功作用于穩(wěn)轉(zhuǎn)SKOV3細胞的PLKO空載體質(zhì)?；虬悬c，使得shRNA表達并導致目的基因LSD1隨多西環(huán)素濃度的增加而逐漸沉默表達；觀察組經(jīng)100 ng/mL多西環(huán)素誘導后LSD1蛋白相對表達量明顯低于同組誘導前及對照組誘導后，H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量明顯高于同組誘導前及對照組誘導后，進一步表明PLKO空載體質(zhì)?；虺晒φ现罶KOV3細胞，經(jīng)多西環(huán)素誘導后可靶向敲減LSD1。

綜上所述，本研究成功構建并篩選出慢病毒干擾LSD1基因表達的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并經(jīng)不同濃度的多西環(huán)素誘導鑒定其表達。本研究為日后深入研究以LSD1為靶點的表觀遺傳學抗腫瘤治療打下了基礎，也說明通過靶向干擾LSD1基因的表達，可影響其下游特異性反應底物H3K4me1、H3K4me2的表達變化，從而為調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供新的思路。

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Construction and identification of stably transfected ovarian cancer cell lines with lentiviral RNA interference-mediated down-regulation of LSD1 gene

WANXiaolei1,LAIWensheng,SHAOGenbao,LIYuanxia,LIUXiuwen,JINJie,WUChaoyang

(1AffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212002，China)

Objective To construct the stably transfected ovarian cancer cell lines SKOV3 with lentiviral RNA interference-mediated down-regulation of lysine-specific demethylase 1 (LSD1) gene and to provide basis for the in-depth study of taking LSD1 gene as a target in the epigenetics anti-tumor treatment. Methods The plasmids was amplified and extracted, and the UV spectrophotometer was used to detect their purity, recording A260/A280. PLKO-TET-On plasmids were transfected into 293T cells via Lipofectamine 2000, The transfection of 293T cells was observed under an inverted fluorescence microscope. Collecting virus supernatants which were infected by ovarian cancer cells SKOV3 (observation group) and the vector PLKO was used as the negative control (control group). The stably transfected cell lines were selected. The cell lines were induced by doxycycline (0, 1, 10, 100 and 1 000 ng/mL) in the observation group, and then they were both induced by 100 ng/mL doxycycline, the expression of LSD1, H3K4me1 and H3K4me2 in the stably transfected cell lines was detected by Western blotting. Results Ultraviolet spectrophotometer showed that the target plasmid A260/A280was around 2.0 with high purity, THM plasmid-transfected 293T cells appeared green fluorescence, which was eukaryotic expression vector of GFP green fluorescent protein, suggesting that transfection was successful. The protein expression level of LSD1 was decreased and its main substration H3K4me1, H3K4me2 expression was increased with the concentration gradient of doxycycline. There were statistically significant differences between multiple concentrations (allP<0.01). The relative expression of LSD1 protein of the observation group induced by 100 ng/mL doxycycline was significantly decreased but the expression of H3K4me1, H3K4me2 was increased as compared with that in the group without doxycycline induction and the control group after the induction of doxycycline (allP<0.01). Conclusion The stably transfected ovarian cancer cell lines SKOV3 with lentiviral RNA interference-mediated down-regulation of LSD1 gene are constructed successfully and identified with concentration gradient of doxycycline induction; this cell line can be used in the epigenetics anti-tumor treatment of taking LSD1 as a target.

lysine-specific demethylase 1; RNA interference; human ovarian cancer SKOV3 cells; stably transfected cells

國家自然科學基金資助項目(81170573)。

萬曉蕾(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為腫瘤分子靶向治療。E-mail： 965261228@qq.com

吳朝陽(1967-)，男，主任醫(yī)師，研究方向為腫瘤綜合治療。E-mail： wuchaoyang9@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.006

R737.31

A

1002-266X(2016)16-0019-04

2015-12-18)