金花茶花粉離體萌發(fā)及低溫處理探究

張佩霞，于波，陳金峰，趙超藝，鄒春萍，孫映波

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境園藝研究所，廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室，廣東　廣州510640)

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金花茶花粉離體萌發(fā)及低溫處理探究

張佩霞，于波，陳金峰，趙超藝，鄒春萍，孫映波

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境園藝研究所，廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室，廣東廣州510640)

摘要：研究了硼酸及蔗糖濃度、培養(yǎng)時間、含水率、低溫對金花茶花粉離體萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，硼酸及蔗糖濃度對花粉萌發(fā)均有顯著影響，當(dāng)硼酸濃度0.1g/L和蔗糖濃度100g/L時，花粉萌發(fā)率最高；25℃培養(yǎng)24h后花粉充分萌發(fā)；花粉含水率為70.39%和52.67%時，低溫處理導(dǎo)致花粉活力降低，甚至喪失，不利于花粉低溫保存。含水率為39.89%和30.90%時，花粉低溫處理后的萌發(fā)相對保持率均維持在86%以上；含水率39.89%的花粉出現(xiàn)“冷刺激”現(xiàn)象，低溫處理后萌發(fā)率回升，新鮮花粉低溫保存前進行適當(dāng)干燥處理有利于萌發(fā)。研究結(jié)果將為金花茶種苗繁育提供參考。

關(guān)鍵詞：金花茶；花粉；離體萌發(fā)；硼酸；蔗糖；含水率；低溫處理

金花茶(Camellianitidissima)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)常綠灌木或小喬木，以山茶家族中唯一具有金黃色花瓣的品種，而聞名于世，享有“茶族皇后”、“植物界大熊貓”之美譽，是中國一級珍稀瀕危保護植物[1～2]。

金花茶在園林觀賞方面具較高價值，屬珍貴稀有觀賞植物。與其他山茶族茶花品種相比，金花茶花瓣金黃、蠟質(zhì)、肥厚，晶瑩剔透，較為罕見，可堪稱世界花壇之尊[3]。此外，金花茶還具有藥用保健價值[4]。在茶花育種界，金花茶是培育黃色花系茶花新品種的寶貴育種材料，許多科研工作者如著名園藝學(xué)家陳俊愉、程金水教授等對其雜交育種做了大量研究工作[5～6]，金花茶花粉活力越高，雜交授粉越容易成功。在金花茶育種過程如何保存花粉，使其保持較高活力，是雜交成功的核心問題。常溫條件花粉一般只能保存3-5d，通過低溫貯藏可以延長花粉保存時間，可解決不同品種茶花之間雜交花期不遇問題。

關(guān)于茶花品種花粉活力的測定及低溫貯藏的研究已有報道[7～8]，但對于金花茶花粉的研究非常少，金花茶花粉含水率對花粉低溫保存的影響則更少，許多花粉貯藏研究缺乏對花粉含水率的測定[9～10]，而花粉含水率是影響花粉低溫保存的主要因素，如果花粉含水率過高，低溫冷凍會嚴重破壞花粉活力[11]，只有適量的含水率才有利于長期低溫保存花粉。因此，本試驗探究了金花茶花粉離體萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基成分濃度、不同培養(yǎng)時間花粉萌發(fā)率及花粉含水率對其低溫保存的影響，以更好地保存金花茶花粉，為茶花新品種培育提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗選用廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝所茶花資源圃內(nèi)的普通金花茶品種，金花茶植株生長健壯，無病害。2015年1月30-31日上午采集花粉，使用毛刷將金花茶花粉收集于硫酸紙袋，及時帶回實驗室供試。

1.2試驗方法

1.2.1花粉萌發(fā)率測定

試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝所重點實驗室進行，采用固體培養(yǎng)基離體培養(yǎng)法進行花粉萌發(fā)試驗。先用解剖針挑取少量花粉放入裝有培養(yǎng)液(固體培養(yǎng)基不加凝固劑)的加樣試管中，充分搖勻，用加樣器吸取花粉液放于玻璃培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿內(nèi)有一層厚度0.5mm左右固體培養(yǎng)基，使花粉液均勻布滿固體培養(yǎng)基表層，25℃全光照培養(yǎng)。運用體視顯微鏡觀察花粉萌發(fā)情況，試驗設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)隨機觀察3個視野，每個視野統(tǒng)計大于100?；ǚ郏ǚ酃荛L度大于花粉直徑的花粉視為萌發(fā)花粉。

花粉萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)花粉數(shù)/觀察花粉總數(shù))×100%。

1.2.2花粉含水率的測定

新鮮花粉含水率70%左右，將花粉保存在硫酸紙袋，放于盛有硅膠干燥劑的玻璃皿內(nèi)，室內(nèi)進行干燥?；ǚ酆蕼y定采用烘干法。將稱量瓶放入130℃烘箱中烘至恒重，稱量數(shù)據(jù)為W1，然后瓶內(nèi)加入0.1～0.2g花粉，稱重數(shù)據(jù)W2，將其放入烘箱，130℃烘1-2h，直至恒重，冷卻稱重，數(shù)據(jù)為W3，相對含水率=(W2-W3)/(W2-W1)×100%，試驗設(shè)置3次重復(fù)，平均值為其相對含水率。

1.2.3蔗糖和硼酸濃度對花粉萌發(fā)率的影響

固體培養(yǎng)基的基本成分為10g/L瓊脂，再在基本成分中添加0.1g/L、0.2g/L和0.3g/L的硼酸及100g/L、150g/L和200g/L的蔗糖，組合形成9種培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH值6.0，試驗設(shè)計具體處理見表1。在25℃恒溫培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3h，觀察花粉萌發(fā)情況，確定最佳培養(yǎng)基質(zhì)，花粉培養(yǎng)操作步驟及統(tǒng)計方法同1.2.1。

1.2.4培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)的影響

選取4種不同含水率金花茶花粉，25℃恒溫培養(yǎng)條件下分別培養(yǎng)3h、24h、48h，觀察花粉萌發(fā)率，確定花粉培養(yǎng)觀察時間。

1.2.5低溫處理對花粉萌發(fā)的影響

選擇適宜的培養(yǎng)基質(zhì)和萌發(fā)時間后，取4種不同含水率金花茶花粉，常溫25℃條件對花粉活力進行測定，再將花粉分別放于4℃、-40℃、-80℃冰箱，低溫處理3d，解凍后觀察花粉萌發(fā)情況?；ǚ勖劝l(fā)相對保持率的計算方法：

相對保持率(%)=(低溫冷凍后萌發(fā)率/低溫冷凍前萌發(fā)率)×100%。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件的最小顯著性差異法(LSD)進行方差分析(ANOVA)。

2結(jié)果與分析

2.1蔗糖和硼酸濃度對花粉萌發(fā)的影響

金花茶花粉在試驗中的9種培養(yǎng)基上萌發(fā)率為10.63%～48.35%，萌發(fā)率LSD多重檢驗結(jié)果表明，萌發(fā)率之間差異顯著(表1)。硼酸及蔗糖濃度兩因素方差分析結(jié)果顯示(LSD法，=0.05)，硼酸對花粉萌發(fā)作用呈顯著性差異(P=0.040<0.05)；蔗糖對花粉萌發(fā)作用呈顯著性差異(P=0.043<0.05)。硼酸濃度0.1g/L時，花粉萌發(fā)率最高，說明低濃度的硼酸利于金花茶花粉的萌發(fā)，濃度過高會抑制其萌發(fā)。蔗糖濃度對花粉萌發(fā)的影響也顯著，在硼酸濃度相同蔗糖濃度100g/L時，金花茶花粉萌發(fā)率最高，說明金花茶萌發(fā)不需要高濃度蔗糖，低濃度蔗糖利于其萌發(fā)。因此，當(dāng)硼酸濃度0.1g/L，蔗糖濃度100g/L時，最利于金花茶花粉萌發(fā)，可作為金花茶花粉萌發(fā)的基本培養(yǎng)基。

表1　不同培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率

注：表中a、b、c、d、e、f為不同處理間LSD多重檢驗結(jié)果(=0.05)。

2.2培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)的影響

取含水率分別為70.39%、52.67%、39.89%和30.90%的金花茶花粉，25℃溫度條件下進行離體萌發(fā)培養(yǎng)，培養(yǎng)基質(zhì)采用2.1中最佳培養(yǎng)基，培養(yǎng)3h、24h、48h后觀察統(tǒng)計萌發(fā)率?；ǚ叟囵B(yǎng)3h萌發(fā)率分別是57.39%、49.37%、50.15%和22.67%；花粉培養(yǎng)24h萌發(fā)率依次是73.85%、73.54%、67.46%和23.15%；花粉培養(yǎng)48h后，花粉管萌發(fā)較長，且相互疊加，體視顯微鏡條件下萌發(fā)率難以觀察統(tǒng)計。

花粉離體培養(yǎng)24h與3h相比，萌發(fā)率分別提高28.68%、48.96%、34.52%和2.12%，說明離體培養(yǎng)3h，花粉未充分萌發(fā)；離體培養(yǎng)48h，花粉管萌發(fā)過長，相互疊加影響觀察，不利于萌發(fā)率統(tǒng)計；離體培養(yǎng)24h，花粉萌發(fā)充分，并能清晰統(tǒng)計萌發(fā)率，適宜作為花粉萌發(fā)率統(tǒng)計的時間點。

2.3低溫處理對不同含水率花粉萌發(fā)的影響

將4種不同含水率的金花茶花粉低溫處理3d，檢測花粉萌發(fā)率，培養(yǎng)基采用2.1中最佳培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間24h，其中以常溫25℃條件金花茶花粉萌發(fā)率為基準，計算3種低溫處理后花粉萌發(fā)的相對保持率(表2)。對試驗中含水率及溫度兩因素進行方差分析(LSD法，=0.05)，結(jié)果表明，金花茶花粉含水率對花粉萌發(fā)作用呈顯著性差異(P=0.03<0.05)；低溫處理作用的差異性不顯著(P=0.2>0.05)，說明金花茶花粉含水率是影響其花粉萌發(fā)率的關(guān)鍵因素。

當(dāng)金花茶花粉含水率高達70.39%時，常溫萌發(fā)率高達73.85%，經(jīng)過4℃、-40℃和-80℃低溫處理，其花粉萌發(fā)率分別降低至22.15%、5.23%和2.19%，相對保持率最低，嚴重影響到花粉活力?；ǚ酆?2.67%時，4℃、-40℃處理后，花粉相對保持率均在92%以上；-80℃處理時，相對保持率僅為6.35%。說明含水率較高時，-80℃低溫會對花粉活力造成傷害?；ǚ酆?9.89%時，花粉經(jīng)過低溫處理，花粉萌發(fā)率較常溫狀態(tài)均出現(xiàn)升高，4℃、-40℃、-80℃低溫處理后，花粉活力相對保持率最佳，分別為107.60%、103.99%和102.62%，低溫處理促進花粉萌發(fā)，即出現(xiàn)“冷刺激”現(xiàn)象，可能是保護酶參與了花粉對低溫脅迫的生理生化反應(yīng)，具體機理需要進一步探究?；ǚ酆?0.9%時，低溫處理后，花粉相對保持率均在86%以上。

表2　不同含水率花粉在不同溫度處理下的萌發(fā)率

注：表中a、b、c、d為不同含水率間LSD多重檢驗結(jié)果(=0.05)。

3結(jié)論與討論

金花茶是培育黃色茶花的優(yōu)良育種材料。常規(guī)雜交育種過程，常出現(xiàn)花期不遇，所以要對花粉進行低溫保存。低溫貯藏后會影響花粉活力，這是限制雜交育種的一個重要問題，唯有高活力花粉，才能保證雜交成功[12]。因此，如何使花粉經(jīng)過低溫保存后仍保持較高活力，在品種培育中極為關(guān)鍵。

花粉離體培養(yǎng)是測定花粉活力的常用方法，操作簡單，結(jié)果準確。本文采用9種固體培養(yǎng)基，用于金花茶花粉離體培養(yǎng)。硼酸和蔗糖濃度對金花茶花粉萌發(fā)率均有顯著影響，低濃度硼酸有利于花粉萌發(fā)，濃度過高會抑制其萌發(fā)，同樣高濃度蔗糖也不利用花粉萌發(fā)，這與謝焰鋒、張濤等的研究結(jié)果一致，也認為高濃度蔗糖對金花茶花粉萌發(fā)有一定抑制作用[13～14]。硼酸濃度為0.1g/L和蔗糖濃度為100g/L，可作為金花茶花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)基。

雖然金花茶新鮮花粉具有較高活力，萌發(fā)率可達73.85%，但含水率在低溫處理前較高時，冷凍后難以保持其活力，必須進行適當(dāng)干燥處理。當(dāng)金花茶含水率在30.9%～39.89%范圍時，花粉低溫處理后，萌發(fā)相對保持率均維持在86%以上，可作為金花茶花粉低溫保存含水率的參考依據(jù)。金花茶花粉含水率在52.67%～70.39%范圍時，低溫后導(dǎo)致花粉活力降低，甚至喪失，不利于金花茶花粉低溫保存。金花茶花粉含水率對低溫處理后花粉活力有顯著影響，耿興敏等在研究唐菖蒲花粉低溫保存時，也發(fā)現(xiàn)含水率對花粉保存效果影響顯著[11]。

金花茶花粉25℃溫度條件離體培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后萌發(fā)率較高，相較于3h培養(yǎng)時間，花粉得以充分萌發(fā)；相較于48h培養(yǎng)時間，花粉管萌發(fā)不會過長，利于顯微鏡下萌發(fā)率觀察統(tǒng)計，因此，24h培養(yǎng)時間適宜作為金花茶花粉離體萌發(fā)率的統(tǒng)計時間點。

金花茶花粉低溫處理，活力均升高，出現(xiàn)“冷刺激”現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在牡丹花粉、茶花‘桂葉金心’花粉等研究中也有報道[7,15]。原因可能是酶在低溫條件下受到抑制，冷熱交替刺激酶活性恢復(fù)，使得花粉萌發(fā)率升高，具體機理還有待深入研究[16]。

許多花粉低溫保存的研究，主要是針對培養(yǎng)基成分及濃度和保存溫度的研究[16～20]，缺乏對花粉含水率的研究，而花粉含水率對低溫保存有顯著影響，直接關(guān)系到花粉保存后的活力及保存期限，因此在研究花粉低溫保存時，有必要加強對花粉含水率的測定。

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Pollen Germination and Low Temperature Treatments of Camellia nitidissima

ZHANG Pei-xia, YU Bo,CHEN Jin-feng, ZHAO Chao-yi, ZOU Chun-ping, SUN Ying-bo

(Environmental Horticulture Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Provincial Key Laboratory of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou Guangdong 510640, P.R.China)

Abstract:The effect of concentration, culture time, water contents and low temperature of boric acid and sucrose on in vitro pollen germination of Camellia nitidissima were studied.The results showed that boric acid and sucrose were significantly affected the pollen germination.When the concentrations of boric acid and sucrose were 0.1g/L, and 100g/L respectively, the pollen germination rate reached the highest.The pollens fully germinated when they were cultured at 25℃for 24 hours.The active ability of pollen would be reduced or even loss when the pollen treated by low temperature with water content rate of 70.39% and 52.67%.The germination relative retention rates of pollens remained above 86% when water contents rate were 39.89% and 30.90% with low temperature treatment.The germination rate of pollen with water content rate of 39.89% recovered at low temperature treatment，which is known as “cold stimulation” phenomenon.It is good for fresh pollen germination if it was dried properly before low temperature preservation.

Key words:Camellia nitidissima;pollen;in vitro germination;boric acid；sucrose；water content rate;low temperature treatment

中圖分類號：S 792.39

文獻標識碼：A

文章編號：1672-8246(2016)02-0094-04

通訊作者簡介：孫映波(1964-)，男，副研究員，主要從事園林植物培育研究。E-mail：sunyingbo20@163.com

第一作者簡介：張佩霞(1985-)，女，碩士，助理研究員，主要從事園林植物應(yīng)用研究。E-mail：agreenchild@163.com

基金項目：茶花資源創(chuàng)新利用與示范平臺建設(shè)(2014B070706016)，花卉育種與開花調(diào)控技術(shù)研究(2011A020102007)，花卉創(chuàng)新團隊崗位專家及綜合示范與培訓(xùn)站長建設(shè)任務(wù)(粵財教[2014]371號)。

*收稿日期：2015-07-13