山羊FSH β基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性研究

姚 毅，馬紅艷，呂學(xué)斌，楊躍奎*（.山西省運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西運(yùn)城044000；.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都60066）

山羊FSH β基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性研究

姚 毅1，馬紅艷1，呂學(xué)斌2，楊躍奎2*
（1.山西省運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西運(yùn)城044000；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066）

本試驗(yàn)對(duì)250只波爾山羊、成都麻羊的FSH β基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在兩個(gè)品種試驗(yàn)羊的FSH β基因5＇調(diào)控區(qū)712bp處存在A→G突變，形成A、B 2種等位基因及AA、AB、BB 3種基因型，且A等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。在平均窩產(chǎn)羔數(shù)方面，兩種山羊初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)的平均窩產(chǎn)羔數(shù)均為基因型AA＞基因型AB＞基因型BB，經(jīng)產(chǎn)個(gè)體的AA型與AB型、BB型差異顯著（P＜0.05），初產(chǎn)個(gè)體各基因型間差異不顯著（P＞0.05）。由此推測，F(xiàn)SH β基因可能是控制山羊繁殖性能的一個(gè)主效基因，為下一步育種工作提供了有力的理論依據(jù)。

成都麻羊；FSH β基因；產(chǎn)羔數(shù)

卵泡刺激素又稱促卵泡激素（FSH），是下丘腦-垂體-性腺軸中的主要激素之一，在動(dòng)物繁殖過程中起重要作用，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增生、刺激類固醇生成、調(diào)節(jié)配子細(xì)胞的發(fā)育和成熟[1]。它是由垂體前葉分泌的一種分子質(zhì)量約為30kD的糖蛋白，由α、β兩種亞基組成，α亞基基因由3個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，在哺乳動(dòng)物中極為保守，而β亞基由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。FSH β亞基基因與產(chǎn)仔數(shù)主效基因存在緊密的遺傳連鎖，是控制豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因，在繁殖過程中起著重要的作用[2]。本試驗(yàn)以FSH β基因作為波爾山羊和成都麻羊產(chǎn)羔性狀的候選基因，采用PCR-SSCP方法進(jìn)一步研究FSH β基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本 用于研究的100只波爾山羊（24只初產(chǎn)羊和76只經(jīng)產(chǎn)羊）均選自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)種羊場，150只成都麻羊（50只初產(chǎn)羊和100只經(jīng)產(chǎn)羊）來自雙流縣成都金田農(nóng)牧公司種羊場。采集山羊血液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取 山羊基因組DNA提取采用酚-氯仿提取法[3]，提取后的DNA用TE緩沖液溶解，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì) 引物參照Guzman等（1991）[4]發(fā)表的綿羊FSH β基因的堿基序列設(shè)計(jì)。引物序列PF：5＇-TTGGCTTCTGTTACATCTC-3＇，PR：5＇-CTTTCCTGAAATGTCCTTGC-3＇。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系10 μL：2×MasterMix 酶5 μL，10 pmo1/μL的PF、PR各0.3 μL，25 ng/μL DNA模板1μL，滅菌超純水3.4μL。PCR反應(yīng)條件為：先94℃預(yù)變性5min，再進(jìn)行34個(gè)循環(huán)（94℃40s，54.5℃40 s，72℃50 s），72℃延伸10 min，4℃保存。取5μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，110 V電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，并拍照保存。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物PCR-SSCP分析 取1μL PCR產(chǎn)物加入5μL變性上樣緩沖液，混勻后于99℃變性5min，然后置于冰上冷卻5min全部上樣。采用12%的聚丙烯酰胺凝膠120 V電泳10h，電泳結(jié)束后銀染顯色并拍照，判斷突變基因型并統(tǒng)計(jì)各種基因型的個(gè)體數(shù)量。

1.6 數(shù)據(jù)模型和統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS S.2軟件GLM過程進(jìn)行最小二乘分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，計(jì)算基因型和基因頻率，比較各種類型在母羊窩產(chǎn)羔數(shù)方面的差異。根據(jù)影響產(chǎn)羔數(shù)性狀的因素，結(jié)合本試驗(yàn)的具體情況建立以下模型：

其中，yijkl為性狀表型值；μ為群體平均值；Bk為品種效應(yīng)；Pj為第j個(gè)胎次的固定效應(yīng)；Gi為第i標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)；（Bk×Gi）為品種與基因型的相互互作效應(yīng)；（Pj×Gi）為胎次與基因型的相互互作效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊FSH β基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 用設(shè)計(jì)引物對(duì)波爾山羊、成都麻羊的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。從圖1可見到一條約為252bp的特異性條帶，條帶清晰且沒有非特異性擴(kuò)增片段，可以直接進(jìn)行SSCP分析。

圖1 山羊FSH β基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 FSH β基因型判斷 對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP多態(tài)性檢測分析，結(jié)果顯示FSH β基因的DNA擴(kuò)增片段表現(xiàn)出了單鏈核苷酸構(gòu)象多態(tài)性（見圖2）。在群體中檢測到A和B 2個(gè)等位基因以及AA、AB和BB 3種基因型。

圖2 FSH β基因擴(kuò)增片段的SSCP分析

2.3 測序結(jié)果分析 將不同基因型的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)有限公司直接測序，再用序列比對(duì)軟件DNAMAN對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步證實(shí)了多態(tài)位點(diǎn)的存在；在FSH β基因5＇調(diào)控區(qū)712bp處有A→G突變（如圖3所示）。

2.4 基因頻率和基因型頻率 對(duì)波爾山羊和成都麻羊進(jìn)行基因分型后，統(tǒng)計(jì)出各基因型頻率和基因頻率，其結(jié)果見表1。由表1可知，波爾山羊群體FSH β基因型頻率為AB＞AA＞BB，AB為優(yōu)勢基因型；成都麻羊群體FSH β基因型頻率為AA＞AB＞BB，AA為優(yōu)勢基因型。兩個(gè)品種的等位基因頻率均為A＞B，A等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。對(duì)該位點(diǎn)的基因頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，得出波爾山羊的χ2值差異極顯著（P＜0.01），偏離了Hardy-Weinberg平衡；成都麻羊的χ2值差異不顯著（P＞0.05），處于Hardy-Weinberg平衡。

圖3 山羊FSH β基因5＇調(diào)控區(qū)AA和BB基因型的序列比較

表1 2個(gè)山羊品種的FSH β基因型頻率和基因頻率

2.5 FSH β基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析 FSH β基因5＇調(diào)控區(qū)擴(kuò)增片段的突變基因型與兩個(gè)山羊群體中產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘法分析結(jié)果見表2。由表2可知，初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)波爾山羊的平均窩產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值關(guān)系為AA＞AB＞BB，經(jīng)產(chǎn)個(gè)體AA型和AB型均顯著高于BB型（P＜0.05），但初產(chǎn)個(gè)體各基因型間差異不顯著（P＞0.05）。初產(chǎn)成都麻羊的FSH β基因AA型比AB、BB型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)分別高0.09頭、0.1S頭，但初產(chǎn)個(gè)體各基因型間差異不顯著（P＞0.05）；經(jīng)產(chǎn)成都麻羊的FSH β基因AA型比AB、BB型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)分別高0.39頭、0.5頭，經(jīng)產(chǎn)個(gè)體AA型顯著高于AB型和BB型（P＜0.05）。

表2 山羊FSH β基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)性狀最小二乘分析

3 分析與結(jié)論

3.1 FSH β基因的多態(tài)性 FSH β基因是目前報(bào)道的繁殖性狀的主效基因[1]。王繼卿等[5]對(duì)小尾寒羊群體的FSH β基因CDS區(qū)的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CDS區(qū)第2外顯子存在多態(tài)性，147bp處發(fā)生了T→C單堿基同義突變。本研究結(jié)果表明，在波爾山羊和成都麻羊的FSH β基因5＇調(diào)控區(qū)存在一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，該區(qū)域內(nèi)第712bp處有A→G突變。

3.2 FSH β基因與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)性 在FSH β基因多態(tài)性方面，王重龍等[6]和李慶崗等[7]在淮豬新品系母豬中的研究結(jié)果表明，F(xiàn)SH β基因的AA基因型為該豬群的有利基因，A等位基因?qū)ωi的繁殖性能具有影響作用。梁琛等[S]研究表明，在濟(jì)寧青山羊中FSH β基因第2外顯子的等位基因A為優(yōu)勢基因，AA基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)高于AB型和BB型。本研究結(jié)果表明，波爾山羊和成都麻羊的AA型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AB型和BB型，A等位基因?yàn)閮?yōu)勢基因，與以上結(jié)論一致。由此進(jìn)一步證明了FSH β基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔數(shù)具有顯著影響，可能是控制多胎性能的一個(gè)主效基因。

[1]甘乾福，任播揚(yáng)，喬慧，等.豬FSH β基因多態(tài)性及其與產(chǎn)仔性能的相關(guān)性分析[J].畜牧與飼料科學(xué)，2011，32（12）：109-111.

[2] Zhao Y F，Li N，Xiao L，et a1.Genetic effects of insertion mutations of retrotransposons of FSH β construct gene on 1itter size of pigs [J].Science in China（Series C），1999，29（1）：S1-S6.

[3] J.薩姆布魯克，D.W拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂，等譯.3版.北京：科學(xué)出版社，2002：463-470.

[4] Guzman K，Mi11er C D，Phi11ips C L，et a1.The gene encoding ovine fo11ic1e stimu1ating hormone beta：iso1ation，characterization，and comparison to a re1ated ovine genomic sequence[J].DNA Ce11 Bio1，1991，10（S）：593-601.

[5]王繼卿，胡江，羅玉柱，等.FSH β基因CDS區(qū)遺傳特征及其與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)系的研究[J].中國畜牧雜志，2010，46（11）：5-6.

[6]王重龍，陶立，琚學(xué)慧.淮豬新品系FSH β亞基基因多態(tài)性及其與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，200S，35（S）：63-65.

[7]李慶崗，王志秀，張博，等.FSH β、ESR和PRLR基因多態(tài)性與淮豬新品系產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性分析[J].養(yǎng)豬，2014（1）：52-55.

[S]梁琛，儲(chǔ)明星，張建海，等.FSH β基因PCR-SSCP多態(tài)性及其與濟(jì)寧青山羊高繁殖力關(guān)系的研究[J].遺傳，2006，2S（9）：1071-1077.

Correlation Between Polymorphism of FSH β Gene and Litter Size on the Goats

YAO Yi1，MA Hongyan1，Lü Xuebin2，et a1.
（1.Yuncheng Vocationa1 and Technica1 Co11ege of Agricu1ture，Shanxi Yuncheng 044000；2.Sichuan Anima1 Science Academy，Sichuan Chengdu 610066，China）

The FSH β gene po1ymorphisms of 250 Boer goats and Chengdu grey goats were detected by PCR-SSCP，the corre1ation between po1ymorphism of FSH β gene and 1itter size was a1so ana1yzed.The resu1ts indicated that the po1ymorphisms of FSH β gene were caused by A→G transversion at the 712th bp position in the 5＇regu1atory.Two a11e1es of A，B and three genotypes of AA，AB and BB were detected in examined popu1ations，and different genotypes had different effects on 1itter size，genotype of AA was significant1y higher than genotypes of AB and BB（P＜0.05）.Therefore，the FSH β gene was possib1e primary gene to contro1 1itter size of the Boer goats and Chengdu grey goats，but it wou1d be confirmed by more research.

Chengdu grey goat；Fo11ic1e stimu1ating hormone β gene；Litter size

SS27.2

B

1001-S964（2016）01-0024-03

2015-0S-31

國家科技支撐計(jì)劃（2011BAD2SB01）。

姚毅（1979—），男，山西河津人，講師，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mai1：1174S276@qq.com

*通訊作者：楊躍奎（19S5—），男，山東濟(jì)寧人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。