小鼠胸腺胚后發(fā)育的組織學(xué)觀察和外周血T淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)變化

劉曉東，彭利蘭，陳科杰，彭 西，吳邦元（.貴州省黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州凱里556000；.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川雅安6504）

小鼠胸腺胚后發(fā)育的組織學(xué)觀察和外周血T淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)變化

劉曉東1，彭利蘭1，陳科杰2，彭 西2，吳邦元2
（1.貴州省黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州凱里556000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625104）

為了研究動物胸腺發(fā)育結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，本試驗(yàn)以健康昆明小鼠為研究對象，通過組織形態(tài)和流式細(xì)胞術(shù)研究不同日齡小鼠胸腺的形態(tài)特點(diǎn)和淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)變化。結(jié)果表明：隨著日齡的增加，小鼠胸腺髓質(zhì)逐漸增寬，胸腺小體增多，結(jié)締組織增加并分隔胸腺形成明顯的小葉結(jié)構(gòu)；外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T淋巴細(xì)胞逐漸增多?？梢娦∈蟮?0日齡時(shí)胸腺已開始發(fā)育成熟，免疫功能逐漸增強(qiáng)。

胸腺；組織形態(tài)；T淋巴細(xì)胞亞群；流式細(xì)胞術(shù)；小鼠

胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，能產(chǎn)生T淋巴細(xì) 胞直接參與機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答；此外胸腺上皮能分泌多種肽類，比如胸腺素、胸腺生長激素、胸腺刺激素等，這些激素的主要功能是保證免疫系統(tǒng)的發(fā)育，控制T淋巴細(xì)胞的分化和成熟，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活動，分化成熟的T淋巴細(xì)胞經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)街車馨推鞴俸土馨徒M織，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能[1]。T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志主要有TCR、CD2+、CD3+、CD4+、CDS+，CD4+和CDS+分別出現(xiàn)在不同功能亞群的T淋巴細(xì)胞表面，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+值以及CD3+CD4+與CD3+CDS+T細(xì)胞比值變化能較好地反映機(jī)體免疫能力的變化[2]。本試驗(yàn)采用昆明小鼠，通過十個(gè)采樣點(diǎn)較為系統(tǒng)地闡釋了胸腺形態(tài)及免疫能力的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及日糧 健康懷孕雌鼠15只，購于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生理實(shí)驗(yàn)室。分籠飼養(yǎng)，溫度控制在1S～22℃，濕度控制在50%～60%，人為制造晝夜交替環(huán)境，自由飲水，每日飼喂兩次飼料，定期更換飲水和墊料。幼鼠于20日齡斷乳后雌雄分籠飼養(yǎng)。在各取樣點(diǎn)隨機(jī)抽取5只雌鼠和5只雄鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

日糧組成：玉米、豆餅、豆粕、魚粉、磷酸氫鈣、硫酸銅、各種維生素、微量元素、添加劑等。營養(yǎng)成分：粗蛋白≥22.5%，粗脂肪≥1.S%，粗纖維≤0.5%，粗灰分≤9.0%，鈣1.0%～1.1%，總磷≥0.35%，食鹽0.30%～0.S0%，賴氨酸≥0.35%，水分≤13.0%。符合實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2 試劑和儀器 試劑：10%福爾馬林，蘇木精-伊紅（HE）染色液，甲苯胺藍(lán)（RTB）染色液，4% EDTA-Na2；儀器：流式細(xì)胞儀，漩渦機(jī)，石蠟切片機(jī)，光學(xué)顯微鏡，光學(xué)顯微照相儀，數(shù)顯恒溫箱，電子天平，離心機(jī)。

1.3 HE染色和甲苯胺藍(lán)染色 分別取1、3、5、7、10、15、20、25、35、50日齡雌雄小鼠各5只，頸椎脫臼處死，取胸腺，以10%福爾馬林固定液固定，脫水，透明，石蠟包埋，5μm切片，每只小鼠的胸腺組織取4張切片，HE染色，100倍光鏡下觀察胸腺髓質(zhì)、皮質(zhì)、分葉情況，400倍光鏡下觀察胸腺中胸腺小體的形態(tài)和分布情況。

1.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群分析 分別取5、10、20、35、50日齡雌雄小鼠各5只，眼底靜脈采血100 μL，用4%EDTA-Na2抗凝，加入大鼠抗小鼠CD3+、CD4+、CDS+單克隆抗體（單克隆抗體購自晶美生物制品有限公司），避光染色30min后，用溶血素裂解紅細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清；再用冰的PBS液沖洗一次后懸浮細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的百分比，并計(jì)算CD3+CD4+與CD3+CDS+T細(xì)胞的比值。

1.5 數(shù)據(jù)處理 用SPSS11.5分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胸腺的形態(tài)學(xué)變化 HE染色可見1日齡小鼠胸腺髓質(zhì)的淡染區(qū)較少，多呈散在分布，皮質(zhì)區(qū)較寬，與髓質(zhì)區(qū)分界不明顯。隨著日齡增加，著色較淺的髓質(zhì)區(qū)逐漸增大，散在的髓質(zhì)部分約從20日齡開始連通呈條帶狀，此后由分散分布逐漸互相貫穿形成大片髓質(zhì)，50日齡可見胸腺中央?yún)^(qū)為整片髓質(zhì)。10日齡之前胸腺小葉不明顯，僅在被膜下局部區(qū)域見有少量的結(jié)締組織；約25日齡時(shí)結(jié)締組織將胸腺分隔成若干小葉，每一小葉中的髓質(zhì)部分清晰可見；至50日齡時(shí)可見胸腺小葉的數(shù)量增加，且每一小葉都相對獨(dú)立。胸腺髓質(zhì)區(qū)可見著色較紅的胸腺小體，1日齡胸腺小體較少，多見網(wǎng)狀上皮細(xì)胞，隨著日齡增加，約5日齡出現(xiàn)中央無核的胸腺小體，此后胸腺小體的數(shù)目緩慢增加，形態(tài)多種多樣，呈橢圓形，也有呈囊狀等不規(guī)則形狀，主要是單個(gè)散在分布。

2.2 T淋巴細(xì)胞亞群的動態(tài)變化 隨著日齡的增長，小鼠外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T淋巴細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，且在20日齡達(dá)到較高水平，此后緩慢增長或出現(xiàn)輕微波動。詳見表1、圖1、圖2。

表1 小鼠血液中T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況

10日齡之前，雄性小鼠外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T淋巴細(xì)胞數(shù)量所占百分比較小；20、35日齡和50日齡時(shí)，各亞群細(xì)胞百分比升高，與5日齡和10日齡比較差異顯著（P＜0.05）；CD3+和CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比在20、35、50日齡時(shí)差異不顯著（P＞0.05）；50日齡時(shí)，CD3+CDS+T淋巴細(xì)胞百分比極顯著高于20日齡和35日齡。CD3+CD4+與CD3+CDS+T細(xì)胞比值在5、10、20日齡和35日齡時(shí)差異不顯著，50日齡時(shí)顯著降低（P＜0.05）。

雌性小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況與雄性小鼠相似。20、35、50日齡時(shí)，多數(shù)亞群細(xì)胞比例極顯著高于5日齡和10日齡，CD3+CD4+與CD3+CDS+T細(xì)胞比值在5、10日齡時(shí)較高，20日齡時(shí)顯著降低（P＜0.05），隨后出現(xiàn)或高或低的波動。

圖1日齡對雄性小鼠血液中T淋巴細(xì)胞亞群的影響

圖2日齡對雌性小鼠血液中T淋巴細(xì)胞亞群的影響

3 討論

3.1 胸腺胚后發(fā)育的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化 本試驗(yàn)觀察顯示，從1日齡到50日齡，小鼠胸腺體積逐漸增大，表明出生之后至性成熟胸腺在持續(xù)發(fā)育，50日齡小鼠處于青壯年階段，仍未觀察到胸腺出現(xiàn)明顯萎縮。此研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果不盡一致。

組織學(xué)觀察顯示，隨著日齡的增長，胸腺髓質(zhì)部分的體積明顯增大，并從最初的散在分布的團(tuán)塊轉(zhuǎn)變?yōu)橄嗷ト诤系拇笃瑓^(qū)域，這與陳海英、鄭玉濤等[4]在大鼠中觀察到的“胸腺在大鼠幼年期時(shí)皮質(zhì)厚，髓質(zhì)只占胸腺體積極小部分，而隨日齡增長胸腺皮質(zhì)由厚變薄”現(xiàn)象是一致的。有研究表明，胸腺不僅是一個(gè)重要的免疫器官，也是一個(gè)分泌器官，如髓質(zhì)上皮中的6型上皮是大型髓質(zhì)上皮細(xì)胞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，含有大量囊泡，具有合成、分泌功能，可分泌胸腺素、胸腺生成素[5]。隨著胸腺髓質(zhì)增寬，其中含有的上皮細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，胸腺素和胸腺生成素的分泌也就相應(yīng)增多，從而活化更多的T淋巴細(xì)胞來參與機(jī)體免疫。

胸腺小體是胸腺的特殊結(jié)構(gòu)，廣泛分布于胸腺髓質(zhì)部分。本試驗(yàn)通過HE染色觀察到了著色較紅且具有同心圓環(huán)狀排列的胸腺小體。在胸腺小體中?？梢娫S多細(xì)胞碎片，說明胸腺小體具有降解和除去死亡細(xì)胞的能力[6]。本試驗(yàn)中觀察到完全無核的胸腺小體極少，常見中央無核、邊緣清晰并可見細(xì)胞核的胸腺小體。

3.2 小鼠外周血T淋巴細(xì)胞的動態(tài)變化 基于T細(xì)胞表面CD抗原的不同，可將T淋巴細(xì)胞分為CD4+和CDS+兩大亞群。CD4+亞群主要包括具有協(xié)助其他免疫細(xì)胞發(fā)揮功能的輔助性T細(xì)胞（Th）和誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞的誘導(dǎo)性T細(xì)胞（Ti）。CDS+亞群則包括能抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和其他T淋巴細(xì)胞分化增殖的抑制性T細(xì)胞（Ts）以及能對靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）[7]。本試驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀對50日齡前小鼠血液中的T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)雄鼠在10日齡前的CD3+、CD3+CD4+和CD3+CDS+數(shù)量保持在較低水平，20日齡后大量增加，此后保持在較高水平；雌鼠雖有小幅波動，但變化規(guī)律與雄鼠相似。有資料顯示健康動物的CD3+CD4+與CD3+CDS+T細(xì)胞比值應(yīng)保持在2∶1[S]。從本試驗(yàn)可以看到，CD3+CD4+與CD3+CDS+T細(xì)胞比值在20日齡之前雖緩慢下降，但仍明顯高于2∶1，此后該比值出現(xiàn)了或高或低的波動，約50日齡時(shí)比值接近于2∶1。說明小鼠外周血T淋巴細(xì)胞隨著日齡的增加逐漸分化發(fā)育完全，在性成熟之后基本穩(wěn)定。CD3+CD4+與CD3+CDS+T細(xì)胞比值在35日齡較高，此后逐漸下降，可能是由于性成熟后胸腺逐漸退變[7]引起。已有體內(nèi)體外的研究證實(shí)，雌激素可使胸腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退行性變化[9]。

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[2]蔡鳳，祝繼英7陳明琪.微生物學(xué)與免疫學(xué)[M].3版.北京：科學(xué)出版社，2014：165-167.

[3]衛(wèi)生部人事司.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)工[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1999：156-162.

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The Histological Observation of Thymus during Postembryonic Period and the Dynamic Change of T Lymphocyte Subsets in Peripheral Blood of Mice

LIU Xiaodong1，PENG 1i1an1，CHEN Kejie2，et a1.
（1.Qiandongnan Nationa1 Vocationa1 and Technica1 Co11ege，Guizhou Kai1i 556000；2.Co11ege of Veterinary Medicine，Sichuan Agricu1tura1 University，Sichuan Ya＇an 625014，China）

In order to study the re1ationship between structure and function of the anima1 thymus deve1opment，hea1thy Kunming mice were used to study the morpho1ogica1 characteristic and the 1ymphocyte subsets changes of the thymus in different days.The resu1ts showed that the vo1ume of thymic medu11a part increased with the days of age increasing and the number of thymic corpusc1es disp1ayed the increasing trend.There were a few mast ce11s in thymus.The number of the periphera1 b1ood CD3+、CD3+CD4+、CD3+CDS+T 1ymphocyte gradua11y increased，the ratio of CD3+CD4+and CD3+CDS+gradua11y reduced.The resu1ts indicated that the thymus of the mice had matured in 50 days of age and the immune function had strengthened gradua11y.

Thymus；Tissue morpho1ogica1；Subsets of T 1ymphocyte；F1ow cytometry；Mouse

SS52.4

B

1001-S964（2016）01-0021-03

2015-0S-25

劉曉東（19S4—），男，四川達(dá)州人，講師，碩士，主要從事畜牧獸醫(yī)教學(xué)科研工作，研究方向：動物病理學(xué)。