外源H2O2對(duì)低溫脅迫下柑橘葉片抗寒性的影響

蔣景龍

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

?

外源H2O2對(duì)低溫脅迫下柑橘葉片抗寒性的影響

蔣景龍

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

摘要：以柑橘品種‘日南1號(hào)’離體秋稍為試材，采用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，研究添加不同濃度H2O2處理對(duì)4℃低溫脅迫下柑橘生長(zhǎng)狀態(tài)和葉片細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率(REC)、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量以及過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性等生理指標(biāo)的影響，篩選緩解柑橘低溫傷害的最佳H2O2處理濃度,探討外源H2O2處理對(duì)柑橘耐寒能力影響機(jī)制。結(jié)果顯示：隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組柑橘葉片卷曲和葉片細(xì)胞膜傷害程度均逐漸加重；外源施加0.2 和1.0 mmol·L(-1) H2O2處理均能緩解低溫脅迫引起的葉片卷曲和萎蔫，降低葉片中REC和MDA的升高，減少葉片細(xì)胞中內(nèi)源H2O2的積累，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的含量和抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性，并以1.0 mmol·L(-1)H2O2緩解效果更為顯著。研究表明，4 ℃低溫能夠引起柑橘離體秋梢葉片卷曲、枯萎、脫落和細(xì)胞膜傷害癥狀，外源1.0 mmol·L(-1)H2O2可以通過提高葉片的脯氨酸含量和SOD、CAT和POD抗氧化酶活性，有效緩解低溫對(duì)柑橘葉片細(xì)胞膜的傷害，從而增強(qiáng)其抗寒性。

關(guān)鍵詞：柑橘；低溫脅迫；外源過氧化氫；抗寒性

柑橘(CitrusreticulataBlanco.)為蕓香科柑橘亞屬常綠小喬木或灌木，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，性喜溫暖濕潤氣候。柑橘在陜西漢中、安康等地分布廣泛，栽培歷史悠久，是陜南地區(qū)農(nóng)業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。陜南地區(qū)地處亞熱帶的北緣，也是中國柑橘種植的最北緣，凍害的多發(fā)地帶。近幾年陜南柑橘連續(xù)遭受周期性大面積凍害。2012～2013年陜南地區(qū)發(fā)生30年一遇的持續(xù)低溫天氣，柑橘受凍面積占全省柑橘總種植面積的1/4，漢中主產(chǎn)區(qū)受災(zāi)尤為嚴(yán)重[1]。研究抗凍機(jī)制或篩選良好的抗凍劑對(duì)提高柑橘的抗凍性和減輕冷凍傷害具有重要意義[2]。眾所周知，過氧化氫(H2O2)是生物體內(nèi)各種生理代謝的副產(chǎn)物，也是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)中最穩(wěn)定的一種，一直被認(rèn)為是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的代謝物，近些年發(fā)現(xiàn)它在生物體內(nèi)還可以作為一種信號(hào)分子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色，如誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉、參與根的向地性生長(zhǎng)、細(xì)胞壁木質(zhì)化、細(xì)胞程序性死亡、側(cè)根的發(fā)育以及花粉管和柱頭相互作用等[3]。當(dāng)植物遭受輕度的生物或非生物脅迫時(shí)，產(chǎn)生的H2O2能夠通過參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)植物的代謝(如光合作用、呼吸作用、蒸騰作用)及保護(hù)系統(tǒng)(如抗氧化脅迫的酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng))，使植物獲得環(huán)境脅迫或生物脅迫的抗性[4]。很多研究表明H2O2與Ca2+和NO一樣可以通過外源噴施或向培養(yǎng)液中添加的方式提高植物的抗逆性，近幾年越來越多的學(xué)者開始研究通過施加H2O2溶液來提高一些作物抗性，例如通過外源施加H2O2提高小麥、水稻、大豆和玉米的耐鹽性、耐冷凍性和耐旱性等[5-7]。然而，針對(duì)不同的植物和不同的脅迫處理，能有效提高抗逆性作用的H2O2濃度差別較大，本研究擬通過分析不同濃度H2O2處理對(duì)4 ℃低溫脅迫下‘日南1號(hào)’柑橘秋稍生長(zhǎng)狀態(tài)和葉片細(xì)胞膜傷害程度、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性等指標(biāo)影響，篩選緩解柑橘低溫傷害的最佳H2O2處理濃度并探討外源H2O2處理對(duì)柑橘耐寒能力影響機(jī)制，以期為提高柑橘抗凍能力提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料培養(yǎng)與H2O2處理

供試材料為柑橘品種‘日南1號(hào)’，由漢中泛亞綠色食品有限公司提供，在陜南柑橘脫毒良種苗木繁育基地保存。剪取生長(zhǎng)整齊、健壯的柑橘秋稍培養(yǎng)在Hoagland營養(yǎng)液中，置于(4±0.5)℃的低溫培養(yǎng)箱中脅迫10 d，空氣相對(duì)濕度為80%，光照時(shí)間為12 h/12 h(晝/夜)，光照度為1 000 lx。將4 ℃低溫培養(yǎng)的柑橘秋稍分為2組，一組向Hoagland營養(yǎng)液中分別加入0.2(T1)、1.0(T2)和5.0 mmol·L-1H2O2(T3)溶液作為處理組，不添加H2O2溶液僅進(jìn)行低溫處理的作為對(duì)照組(CK)，每個(gè)處理設(shè)置3瓶，每瓶培養(yǎng)3個(gè)柑橘秋稍。分別在H2O2處理的第2、4、6、8和10 d進(jìn)行葉片采樣，一部分葉片直接用于H2O2組織化學(xué)染色和相對(duì)電導(dǎo)率的檢測(cè)，其余每份均取0.5 g用錫箔紙包好保存在-80 ℃冰箱中以檢測(cè)其他生理指標(biāo)，所有指標(biāo)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1形態(tài)觀察將培養(yǎng)在Hoagland營養(yǎng)液中的對(duì)照組(CK組)和各處理(T1、T2和T3)組柑橘離體秋稍分別在處理的第2、4、6、8和10天進(jìn)行觀察，并利用Canon數(shù)碼照相機(jī)EOS600D進(jìn)行數(shù)碼拍照。

1.2.2葉片相對(duì)電導(dǎo)率將對(duì)照組和處理組的柑橘葉片分別用自來水和蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗1次后濾紙吸干表面水分，將葉片避開主脈剪成長(zhǎng)條，快速稱取3份，每份0.1 g，分別置于含20 mL去離子水的刻度試管中，室溫下浸泡處理12 h，用雷磁DDSJ-308F型電導(dǎo)率儀測(cè)定葉片浸提液電導(dǎo)率，記為R1；然后將裝有葉片浸提液的試管放入水浴鍋沸水浴30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測(cè)定浸提液電導(dǎo)率，記為R2，最后計(jì)算葉片相對(duì)電導(dǎo)率(REC)。REC=(R1/R2)×100%。

1.2.3H2O2組織化學(xué)定位與染色分別取對(duì)照組和處理組的柑橘葉片進(jìn)行H2O2組織化學(xué)定位與染色，染色方法參照J(rèn)iang等[8]的方法。用H2O2的特異性染色試劑二氨基聯(lián)苯胺(3,3-Diaminobenzidine，DAB)檢測(cè)葉片中內(nèi)源H2O2的組織定位，依據(jù)葉片染色范圍和染色程度判斷柑橘葉片內(nèi)源H2O2組織分布變化和積累程度。

1.2.4其他生理指標(biāo)葉片丙二醛(MDA)含量測(cè)定參照Farooq等[9]的方法，葉片中脯氨酸含量與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT) 和 過氧化物酶(POD)活性均參照李玲等[10]的方法測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1外源H2O2對(duì)低溫脅迫下柑橘離體枝條葉片形態(tài)的影響

就對(duì)照組而言，在4 ℃低溫脅迫處理2 d時(shí)，柑橘離體枝條葉片無明顯變化(圖1,A)；在低溫處理4～6 d時(shí)，部分柑橘葉片開始出現(xiàn)卷曲(圖1,B、C)；處理8 d時(shí)，80%柑橘葉片出現(xiàn)卷曲，卷曲程度明顯比處理4～6 d時(shí)嚴(yán)重(圖1,D)；當(dāng)?shù)蜏靥幚?0 d時(shí)，所有的葉片全部出現(xiàn)卷曲，部分葉片甚至開始干枯死亡(圖1,E)。T1組觀察結(jié)果顯示，低溫處理4 d以前，柑橘葉片無卷曲癥狀出現(xiàn)(圖1,F、G)；處理6 d時(shí)開始出現(xiàn)葉片卷曲(圖1,H)，但卷曲的葉片數(shù)量和卷曲程度明顯比同期對(duì)照組要輕，處理8和10 d時(shí)也未出現(xiàn)大部分葉片卷曲或干枯現(xiàn)象(圖1,I、J)，由此表明施加0.2 mmol·L-1H2O2有效緩解了低溫脅迫對(duì)柑橘的傷害。當(dāng)外源施加H2O2濃度增加至1.0 mmol·L-1時(shí)(T2組)，其緩解低溫脅迫對(duì)柑橘的傷害作用更加顯著，低溫處理10 d的整個(gè)過程中幾乎沒有葉片卷曲的現(xiàn)象出現(xiàn)(圖1,K～O)。T3組觀察結(jié)果顯示，5.0 mmol·L-1H2O2不僅沒有減輕低溫脅迫對(duì)柑橘造成的傷害，反而對(duì)低溫脅迫的柑橘造成了更嚴(yán)重的傷害，在處理4 d就開始出現(xiàn)了大部分葉片卷曲現(xiàn)象(圖1,Q)，處理8 d卷曲更加嚴(yán)重而且還出現(xiàn)了部分葉片萎蔫干枯的癥狀(圖1,S)，處理10 d時(shí)有部分葉片已經(jīng)開始脫落(圖1,T)。柑橘離體枝條葉片形態(tài)的變化表明，外源1.0 mmol·L-1H2O2能夠有效緩解低溫脅迫對(duì)柑橘離體枝條葉片的傷害。

2.2外源H2O2處理對(duì)低溫脅迫下柑橘離體枝條葉片相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響

在4 ℃低溫脅迫處理下，對(duì)照及處理組柑橘離體枝條葉片的相對(duì)電導(dǎo)率(REC)均隨處理時(shí)間而逐漸顯著增加(表1)。其中，對(duì)照組柑橘離體枝條葉片的REC在處理2～10 d顯著提高了4.46倍，表明葉片細(xì)胞膜受損傷程度隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)也越來越嚴(yán)重。在T1處理組中，柑橘葉片REC在低溫脅迫2～4 d與對(duì)照組無明顯差異，在低溫處理6 d時(shí)比對(duì)照組顯著降低了23%，處理10 d時(shí)顯著降低了28%，表明外源施加0.2mmol·L-1H2O2處理降低了低溫脅迫導(dǎo)致的葉片REC上升。在T2組處理下，柑橘葉片的REC在低溫脅迫4 d時(shí)比同期對(duì)照組顯著降低了33.5%，處理10 d時(shí)則顯著降低了48%，表明T2比T1處理能更有效緩解低溫脅迫下柑橘葉片REC的升高趨勢(shì)。與T2和T1處理組表現(xiàn)不同，T3組處理不僅沒有緩解低溫脅迫誘導(dǎo)的柑橘葉片REC上升趨勢(shì)，反而使柑橘葉片REC上升更高，在處理2 d時(shí)已比同期對(duì)照升高了30.8%，處理10 d時(shí)上升幅度略有降低但仍比對(duì)照升高了9.9%，表明5.0 mmol·L-1H2O2處理沒有緩解低溫脅迫下柑橘葉片REC的升高，反而有加劇作用。同時(shí)，柑橘葉片中MDA含量的變化趨勢(shì)與REC變化趨勢(shì)基本相似，也是隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高，外源0.2和1.0 mmol·L-1H2O2處理均能有效緩解低溫脅迫下柑橘葉片MDA含量的升高，且1.0 mmol·L-1H2O2處理效果更好；5.0 mmol·L-1H2O2處理反而促進(jìn)了葉片MDA含量的進(jìn)一步升高，加劇了低溫脅迫傷害的程度。各處理組間數(shù)據(jù)比較顯示，柑橘葉片中MDA含量與REC變化均從處理的第6天開始出現(xiàn)顯著性差異。

CK、T1、T2、T3分別表示0、0.2、1.0、和5.0 mmol·L-1H2O2 處理；下同。

檢測(cè)指標(biāo)Detectionindex處理時(shí)間Treatmenttime2d4d6d8d10d相對(duì)電導(dǎo)率REC/%CK14.46±1.34eB36.90±1.59dB47.57±0.87cB53.77±1.95bB64.56±1.26aBT115.75±0.9cB32.27±3.44bB36.50±2.08bC44.09±1.55aC46.64±1.57aCT215.68±0.93dB24.53±2.44bC27.58±2.14bD30.18±1.96bD33.56±1.49aDT320.92±1.93eA40.17±2.22dA58.96±1.34cA63.25±1.84bA71.67±2.57aA丙二醛含量MDAcontent/(μmol·g-1)CK2.45±0.12dB4.56±0.25cA5.57±0.14bB5.40±0.19bB8.93±0.33aBT12.75±0.16dB3.61±0.12cB4.83±0.09bC4.76±0.46bC5.30±0.04aCT22.81±0.10bB3.20±0.44aB3.58±0.19aD3.52±0.23aD3.57±0.50aDT33.65±0.15dA4.50±0.30cA6.63±0.20bA6.79±0.34bA9.34±0.10aA

注：同行不同小寫字母表示不同處理時(shí)期間在0.05水平存在顯著性差異；同列不同大寫字母表示同一處理時(shí)間對(duì)照組和不同濃度H2O2處理組間在0.05水平存在顯著性差異。

Note:The different normal letters in the same row indicate significant difference among different treatment time at 0.05 level;The different capital letters in the same list indicate significant difference among treatments with different concentrations of H2O2at 0.05 level.

2.3外源H2O2處理對(duì)低溫脅迫下柑橘離體枝條葉片H2O2積累的影響

DAB能夠與H2O2反應(yīng)生成紅褐色物質(zhì)，因此紅褐色物質(zhì)的出現(xiàn)反映了組織內(nèi)H2O2的積累情況。圖2可以看出，對(duì)照組柑橘葉片在4 ℃低溫脅迫處理2 d時(shí)幾乎沒有明顯的紅褐色物質(zhì)出現(xiàn)(圖2，A)，在低溫處理4 d時(shí)葉片的左下角凍傷區(qū)有明顯的紅褐色出現(xiàn)，反映出柑橘葉片的凍傷部位出現(xiàn)了明顯的H2O2積累(圖2，B)，在處理6 d時(shí)柑橘葉片左側(cè)出現(xiàn)了大面積的H2O2積累(圖2，C)，在低溫處理8 d后柑橘葉片中的H2O2積累繼續(xù)增高，葉片的大部分組織部位出現(xiàn)H2O2積累(圖2，D)，當(dāng)?shù)蜏孛{迫10 d時(shí)幾乎全部柑橘葉片出現(xiàn)嚴(yán)重卷曲，H2O2積累更加嚴(yán)重(圖2，E)。同時(shí)，T1組低溫處理8和10 d時(shí)柑橘葉片均出現(xiàn)了H2O2積累(圖2,I～G)，但其積累的程度明顯比未對(duì)照組要輕；T2組柑橘葉片中的H2O2積累明顯降低，甚至處理10 d時(shí)H2O2積累量仍然很低(圖2,O)；T3組柑橘葉片中的H2O2積累沒有明顯的降低趨勢(shì)，但與同期對(duì)照組相比H2O2積累較輕(圖2,P～T)。以上結(jié)果表明，柑橘離體枝條葉片中H2O2積累水平隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，當(dāng)外源施加0.2和1.0 mmol·L-1H2O2時(shí)其H2O2積累水平明顯降低，并以1.0 mmol·L-1H2O2處理的降低效果最為顯著。

2.4外源H2O2處理對(duì)低溫脅迫下柑橘離體枝條葉片脯氨酸含量和抗氧化酶活性的影響

隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CK組和T1、T2、T3處理組柑橘葉片的脯氨酸含量均呈逐漸升高趨勢(shì)，且在處理10 d達(dá)到最大值(圖3，A)。其中，對(duì)照組柑橘葉片的脯氨酸含量在4 ℃低溫脅迫處理2～10 d期間提高了1.78倍；T1組柑橘葉片脯氨酸含量在處理6和10 d時(shí)分別比處理2 d相比升高1.62和2.26倍；T2組葉片的脯氨酸含量在處理6和10 d時(shí)分別比處理2 d時(shí)升高2.06和2.46倍，且在處理期間始終明顯高于同期對(duì)照組，在低溫處理10 d時(shí)幾乎是同期對(duì)照組的2倍；T3組柑橘葉片中脯氨酸含量始終低于同期對(duì)照，且處理期間變化幅度不大?？梢姡魈幚砣~片脯氨酸含量均隨低溫脅迫處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高，外源1.0和0.2 mmol·L-1H2O2處理提高了脯氨酸含量的增幅，并以1.0 mmol·L-1H2O2處理的效果較好，而5.0 mmol·L-1H2O2處理則有降低脯氨酸含量的效應(yīng)。

CK、T1、T2、T3分別表示0、0.2、1.0、和5.0 mmol·L-1H2O2 處理，

同時(shí)，各處理組柑橘葉片中SOD活性隨低溫處理時(shí)間均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，CK和T3處理組在處理的4 d后達(dá)到最大值，而T1和T2組則在處理6 d后達(dá)到最大值；在低溫處理的6～10 d，各處理組柑橘葉片中SOD活性均以T2處理最高，T1處理其次，T3組和CK組最低(圖3，B)。各處理組柑橘葉片中CAT酶活性也隨處理時(shí)間呈先升高后降低的趨勢(shì)，均在處理2 d后增速較快，至處理6 d時(shí)達(dá)到最大值；在處理2 d時(shí)，各處理及對(duì)照間無顯著性差異，在處理4～10 d，柑橘葉片中CAT活性及其升幅表現(xiàn)為T2>T1>CK>T3(圖3，C)。各處理柑橘葉片中POD活性變化趨勢(shì)和SOD活性相似，整體也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，且在處理后的6～10 d仍以T2組最高，T1組其次，CK組和T3組最低(圖3，D)。以上結(jié)果說明1.0和0.2 mmol·L-1H2O2處理均明顯提高了低溫脅迫下柑橘葉片中SOD、CAT、POD活性，有效緩解低溫脅迫引起的過氧化傷害，并以1.0 mmol·L-1H2O2處理效果更明顯。

3討論

葉片是柑橘進(jìn)行光合作用和呼吸的主要器官，同時(shí)也是凍害最容易侵襲的部位，輕凍時(shí)可使柑橘葉片表皮細(xì)胞受害，葉片慢慢卷縮，光合作用減弱，重凍時(shí)則使柑橘葉片呈桶狀卷曲，很快凋萎干枯，落葉嚴(yán)重，光合作用停止[1]。本研究結(jié)果顯示‘日南1號(hào)’柑橘離體秋稍經(jīng)4 ℃低溫脅迫處理10 d后，其葉片由輕微卷曲到嚴(yán)重卷曲再到萎蔫干枯脫落，而外源施加0.2～1.0 mmol·L-1H2O2能夠緩解了低溫脅迫引起的柑橘葉片卷曲和萎蔫，提高柑橘的抗凍性。Ishibashia等[11]研究表明，向干旱脅迫8 d的大豆葉片噴施1.0 mmol·L-1H2O2可以延遲葉片萎蔫并提高葉片的相對(duì)含水量，本研究結(jié)果與之一致。

圖3　H2O2處理對(duì)低溫脅迫下柑橘離體枝條葉片脯氨酸含量和SOD,CAT,POD活性的影響

相對(duì)電導(dǎo)率(REC)和MDA含量均是植物遭受低溫脅迫后細(xì)胞膜透性變化的重要生理指標(biāo)，能有效反映細(xì)胞膜系統(tǒng)遭受低溫傷害的程度，且大多數(shù)植物在低溫脅迫下REC和MDA含量升高[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柑橘葉片的REC經(jīng)4 ℃低溫脅迫處理10 d后顯著升高，其細(xì)胞膜受損傷程度隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)也愈加嚴(yán)重，施加0.2～1.0 mmol·L-1H2O2處理10 d后有效緩解低溫脅迫造成的柑橘葉片REC大幅升高的趨勢(shì)，但濃度超過5.0 mmol·L-1時(shí)作用不明顯甚至后期加重低溫脅迫造成的傷害。研究表明，先后通過向4 ℃低溫處理36 h的綠豆葉片噴施200 mmol·L-1H2O2，綠豆幼苗的存活率由30%提高到70%，相對(duì)電導(dǎo)率由86%降低到21%[6,14-15]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然與之相似，但施用的H2O2濃度卻相差很大，這可能與處理的植物、處理時(shí)間和取材差異有關(guān)。同時(shí)，本研究中柑橘葉片中MDA含量的變化趨勢(shì)與REC變化趨勢(shì)基本相似，也是隨低溫時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高，1.0 mmol·L-1H2O2處理能緩解低溫脅迫下柑橘葉片MDA含量的升高。李金亭等[16]研究結(jié)果也表明0.05 μmol·L-1H2O2處理降低了150 mmol·L-1NaCl鹽脅迫處理引起的MDA含量升高。另外，本研究中H2O2的DAB組織化學(xué)定位結(jié)果表明，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，柑橘葉片中H2O2積累水平逐漸上升，1.0 mmol·L-1H2O2處理對(duì)低溫脅迫柑橘葉片中H2O2積累的降低效果最為顯著，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了各劑量外源H2O2處理對(duì)低溫脅迫下柑橘葉片細(xì)胞膜受損害的緩解效應(yīng)。

脯氨酸為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[17]，而SOD、CAT和POD均是植物細(xì)胞內(nèi)清除活性氧和維持植物體內(nèi)活性氧的重要酶[18]，它們對(duì)維持細(xì)胞膜的完整性及提高植物的抗逆性具有重要的意義。本研究結(jié)果表明，外源施加合適濃度的H2O2處理可以提高低溫脅迫下柑橘葉片的滲透調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)了柑橘葉片中的SOD、CAT和POD等抗氧化酶的活性，增強(qiáng)了ROS清除能力，但隨H2O2處理濃度增至5.0 mmol·L-1時(shí)超出了抗氧化系統(tǒng)自我調(diào)節(jié)的范圍，抗氧化系統(tǒng)活性又表現(xiàn)出了明顯的下降趨勢(shì)。Neto等[19]向水培玉米根中施加1 umol·L-1H2O2進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)H2O2減輕了NaCl脅迫對(duì)鹽脅迫敏感型玉米的傷害，提高了SOD、 CAT和POD的活性，從而使鹽敏感型玉米獲得了更高的鹽耐受能力。吳國榮等研究證實(shí)適宜濃度H2O2預(yù)處理鹽澤螺旋藻誘導(dǎo)提高了其SOD、CAT和POD的活性，有效地抑制了藻細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累[20]，這與本研究中1.0和0.2 mmol·L-1H2O2處理組柑橘葉片中SOD、CAT和POD活性表現(xiàn)一致。

綜上所述，4 ℃低溫處理能夠引起柑橘離體秋梢葉片卷曲、枯萎、脫落等受害癥狀，外源噴施1.0 mmol·L-1H2O2可以提高低溫脅迫下柑橘葉片的脯氨酸含量與SOD、 CAT和POD抗氧化酶活性，有效緩解低溫對(duì)柑橘葉片細(xì)胞膜的傷害，從而增強(qiáng)其耐寒性。該研究為后期開發(fā)含H2O2的抗凍劑和柑橘凍害的防控提供了重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

[1]李新生,江海,郭念文.陜西柑橘資源與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)研究[M].北京:科學(xué)出版社,2014.

[2]陳志遠(yuǎn),邸麗俊,王國棟,等.柑橘凍害抵抗分子機(jī)理研究進(jìn)展[J].北方園藝,2014,38(1):188-191.

CHEN Z Y,DI L J,WANG G D,etal.Review of molecular mechanism of cold resistance in Citrus[J].NorthernHorticulture,2014,38(1):188-191.

[3]JIANG J L,SU M,WANG L Y,etal.Exogenous hydrogen peroxide reversibly inhibits root gravitropism and induces horizontal curvature of primary root during grass pea germination[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2012,53(4):84-93.

[4]張軍,孫樹貴,王亮明,等.孕穗期低溫對(duì)冬小麥生理生化特性和產(chǎn)量的影響[J].西北植物學(xué)報(bào),2013,33(11):2 249-2 256.

ZHANG J,SUN SH G,WANG L M,etal.Physiological and biochemical characteristics and yield of winter wheat under low temperature at booting stage[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2013,33(11):2 249-2 256.

[5]SAHIN-CEVIK M,MOORE G A.Identification and expression analysis of cold-regulated genes from the cold-hardy citrus relativePoncirustrifoliata(L.) Raf[J].PlantMolecularBiology,2006,62(1-2):83-97.

[6]HUNG S H,WANG C C,IVANOV S V,etal.Repetition of hydrogen peroxide treatment induces a chilling tolerance comparable to cold acclimation in mung bean[J].JournaloftheAmericanSocietyforHorticulturalScience,2007,132(6):770-776.

[7]GEETIKA SIRHINDI M K,BHARDWAJ R,KUMAR S,etal.Effect of exogenous H2O2on antioxidant enzymes ofBrassicajunceaL.seedlings in relation to 24-epibrassinolide under chilling stress[J].IndianJournalofBiochemistryandBiophysics,2010,47(6):378-382.

[8]JIANG J L,SU M,CHEN Y R,etal.Correlation of drought resistance in grass pea (LathyrussativusL.) with reactive oxygen species scavenging and osmotic adjustment[J].Biologia,2013,68(2):231-240.

[9]FAROOQ M,BASRA S M A,WAHID A,etal.Improving the drought tolerance in rice (OryzasativaL.) by exogenous application of salicylic acid[J].JournalofAgronomyandCropScience,2009,195(4):237-246.

[10]李玲,李娘輝,蔣素梅,等.植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:科學(xué)出版社,2009.

[11]ISHIBASHIA Y S ,HARUKA Y,TAKASHI Y,etal.Hydrogen peroxide spraying alleviates drought stress in soybean plants[J].JournalofPlantPhysiology,2011,168(13):1 562-1 567.

[12]徐維杰,袁婷,楊寅桂,等.南昌市6種棕櫚科植物低溫脅迫的生理響應(yīng)[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(6):1 212-1 216.

XU W J,YUAN T,YANG Y G,etal.The physiological response to low temperature stress of six palme plants in nanchang[J].ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis,2013,35(6):1 212-1 216.

[13]李冬花,陳銀萍,鮑美娥,等.外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下圓柏屬植物幼苗生理特性的影響[J].廣西植物,2014,34(2):220-226.

LI D H,CHEN Y P,BAO M E,etal.Effect of exogenous salicylic acid on physiological characteristics of sabina seedlings under low temperature stress[J].Guihaia,2014,34(2):220-226.

[14]YU C W,MURPHY T M,SUNG W W,etal.H2O2treatment induces glutathione accumulation and chilling tolerance in mung bean[J].FunctionalPlantBiology,2002,29(9):1 081-1 087.

[15]YU C W,MURPHY T M,LIN C H.Hydrogen peroxide-induced chilling tolerance in mung beans mediated through ABA-independent glutathione accumulation[J].FunctionalPlantBiology,2003,30(9):955-963.

[16]李金亭，趙萍萍，邱宗波，等.外源H2O2對(duì)鹽脅迫下小麥幼苗生理指標(biāo)的影響[J].西北植物學(xué)報(bào),2012,32(9):1 796-1 801.

LI J T,ZHAO P P,QIU Z B,etal.Effects of exogenous hydrogen peroxide on the physiological index of wheat seedlings under salt stress[J].ActaBot.Boreal-OccidentSin.,2012,32(9):1 796-1 801.

[17]李自龍,徐雪風(fēng),焦健,等.不同品種油橄欖離體葉片對(duì)滲透脅迫的生理響應(yīng)及其抗旱機(jī)制[J].西北植物學(xué)報(bào),2014,34(9):1 808-1 814.

LI Z L,XU X F,JIAO J,etal.Physiological responses and mechanism of drought resistance in leaves of different Olive varieties under osmotic stress[J].ActaBot.Boreal-OccidentSin.,2014,34(9):1 808-1 814.

[18]張夢(mèng)如,楊玉梅,成蘊(yùn)秀,等.植物活性氧的產(chǎn)生及其作用和危害[J].西北植物學(xué)報(bào),2014,34(9):1 916-1 926.

ZHANG M R,YANG Y M,CHENG Y X,etal.Generation of reactive oxygen species and their functions and deleterious effects in plants[J].ActaBotBoreal-OccidentSin,2014,34(9):1 916-1 926.

[19]NETO A D,PRISCO J T,ENéAS-FILHO J,etal.Hydrogen peroxide pre-treatment induces salt stress acclimation in maize plants[J].JournalofPlantPhysiology,2005,162(10):1 114-1 122.

[20]吳國榮,陸長(zhǎng)梅,陶明煊,等.百草枯和H2O2預(yù)處理提高鹽澤螺旋藻對(duì)鉛的耐受性[J].湖泊科學(xué),2000,12(3):240-246.

WU G R,LU C M,TAO M X,etal.Enhancement of spriulina subsalsa tolerance to pb by pretreatment of paraquat and H2O2[J].JournalofLakeSciences,2000,12(3):240-246.

(編輯:裴阿衛(wèi))

Effect of Exogenous H2O2Treatment on Cold Resistance ofCitrusreticulataLeaves under Low Temperature Stress

JIANG Jinglong

(School of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong,Shaanxi 723001,China)

Abstract:Fall shoot of Citrus(Citrus reticulata Blanco.‘Nichinan No.1’) cultured in hoagland hydroponic solution were used as experimental materials to study effects of different concentration of H2O2 treatments on growing state and physiological indexes of relative electric conductivity(REC),contents of malondialdehyde (MDA) and proline as well as activities of catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD) and peroxidase(POD) in C.reticulata leaves under 4 ℃ low temperature stress.Meantime optimum H2O2 concentration was selected to alleviate chilling injury of C.reticulata and the mechanism of tolerance to cold in C.reticulata with exogenous H2O2 treated was also explored.Results showed that the degree of curl and cell membrane damage of leaf gradually increased with the extension of low temperature stress time in all treated groups of C.reticulata.Both 0.2 mmol·L(-1 )and 1.0 mmol·L(-1)concentrations of H2O(2 )applied to hydroponic solution could ease C.reticulata leaves curling and wilting caused by low temperature stress,lower the increase of REC and MDA,reduce the accumulation of H2O2,and increase the content of osmotic proline and activities of SOD,CAT and POD in C.reticulata leaves.The 1.0 mmol·L(-1) of H2O(2 )alleviated chilling stress on C.reticulata damage more significant than that of the concentration of 0.2 mmol·L(-1).The studies confirmed that the symptoms of leaf curl,wither,fall off and cell membrane damage were caused by treatment of 4 ℃ low temperature in autumn shoots leaves of C.reticulata.And the treatment of 1.0 mmol·L(-1)H2O2could increase the content of proline and activities of SOD,CAT and POD under low temperature stress,and effectively relieve the damage of cell membrane under low temperature in C.reticulata leaves,to enhance its cold resistance.

Key words:Citrus reticulata;low temperature stress;exogenous hydrogen peroxide;cold resistance

中圖分類號(hào)：Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡(jiǎn)介：蔣景龍(1980-)，男，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事逆境植物學(xué)方面的研究。E-mail：jiangjinglong511@163.com

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2014JQ3113)；陜西省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(14JK1158)；陜西理工學(xué)院科研基金(SLGKY15-41)；陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金(SLGYCX1517)。

收稿日期：2015-12-14；修改稿收到日期：2016-03-09

文章編號(hào):1000-4025(2016)03-0499-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0499