西藏八角蓮與桃兒七根及根莖SSH文庫的建立

袁　芳,甄梓娟,徐元江,蘭小中*

(1 西藏大學 農(nóng)牧學院,西藏林芝 860000;2 西藏大學 農(nóng)牧學院-西南大學藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心,重慶 400715)

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西藏八角蓮與桃兒七根及根莖SSH文庫的建立

袁芳1,2,甄梓娟1,徐元江1,蘭小中1,2*

(1 西藏大學 農(nóng)牧學院,西藏林芝 860000;2 西藏大學 農(nóng)牧學院-西南大學藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心,重慶 400715)

摘要:以西藏八角蓮(Dysosma tsayuensis Ying)和桃兒七[Sinopodophyllum hexandrum (Royle) Ying]為材料,構建其根及根莖的SSH文庫,從中篩選鬼臼類植物屬種間與鬼臼毒素生物合成相關的差異表達基因。從文庫中隨機挑取201個陽性克隆測序后得到183條ESTs。去除載體序列和冗余序列,聚類拼接得到17個西藏八角蓮的unique ESTs。經(jīng)BLAST同源比較和功能查尋,有功能注釋的unique ESTs共12個,占70.6%,所編碼的蛋白涉及光合作用、合成代謝、轉錄調控等功能;無功能注釋和匹配結果的共5個,占29.4%。該研究成功構建了西藏八角蓮和桃兒七SSH文庫,為進一步揭示鬼臼毒素生物合成途徑及其調控機制奠定了基礎。

關鍵詞:西藏八角蓮;桃兒七;SSH文庫;鬼臼毒素;EST

鬼臼類植物隸屬于小檗科(Berberidaceae),包括八角蓮屬(DysosmaWoodson)、足葉草(鬼臼)屬(PodophyllumL.)、桃兒七屬(SinopodophyllumYing)和山荷葉屬(DiphylleiaMichx.)[1-2]。鬼臼類植物是一類具有顯著生物活性,又具有悠久應用歷史的藥用植物。中國漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有鬼臼的記載,在以后的本草典籍中亦多記載,鬼臼類植物主要用于治療蛇咬傷、癰癤腫毒、跌打、風濕筋骨痛及氣管炎等癥[3-4]。鬼臼類植物的活性成分主要為木脂素類化合物,其中鬼臼毒素具有高效抗腫瘤活性,已作為合成多種抗癌藥物的前體物質[5-10]。

由于過度采挖、生境破壞和植物自身生長緩慢等原因,鬼臼類野生植物資源逐漸枯竭、物種瀕危,已難以滿足鬼臼毒素生產(chǎn)的需求。人工規(guī)范化栽培勢在必行,但目前桃兒七、八角蓮的栽培剛剛起步,其他來源植物的新資源開發(fā)也有待進一步深入[11-13]。此外,雖然化學全合成技術已經(jīng)有所突破,但復雜的合成過程、極低的合成效率(約為5.0%),使人工全合成鬼臼毒素目前仍難以實現(xiàn)商業(yè)化[14-15]。近年來基于生物技術的植物代謝工程,為鬼臼毒素替代資源的開發(fā)提供了更多途徑,如植物細胞或器官培養(yǎng)、生物轉化等,但實現(xiàn)藥用植物規(guī)范化栽培和植物細胞或器官培養(yǎng)生產(chǎn)鬼臼毒素的前提之一,是必須充分闡明鬼臼毒素的生物合成途徑及其調控機制。目前,鬼臼毒素生物合成途徑尚不十分清楚,對合成途徑中的中間產(chǎn)物、酶、限速步驟等仍知之甚少[16-18]。

就發(fā)現(xiàn)與某一性狀相關基因的方法來講,抑制差減雜交(SSH)被認為是一種較為適合的技術,可在轉錄水平上發(fā)現(xiàn)兩材料間差異表達的基因。自1996年報道SSH的方法以來,已成功應用在多種植物上,發(fā)現(xiàn)了多個與表型性狀相關的功能基因,并成功揭示了動植物中一些生命活動的分子機理[19-23]。本研究選用在鬼臼毒素含量上具顯著差異的西藏八角蓮和桃兒七2種鬼臼類植物作為材料,分別提取根及根莖的mRNA,以西藏八角蓮材料的cDNA作檢測樣品,桃兒七材料的cDNA作參照樣品,構建SSH文庫,測定和分析文庫中的ESTs序列從而發(fā)現(xiàn)西藏八角蓮根及根莖優(yōu)勢表達的基因。以期為今后鬼臼毒素合成相關基因的確定、從分子水平上探究鬼臼毒素生物合成機理以及功能基因輔助鬼臼類藥用植物品種的選育奠定基礎。

1材料和方法

1.1植物材料與處理

供試材料西藏八角蓮、桃兒七采自西藏林芝市米林縣,為避免不同的遺傳背景造成的假陽性,將植株移栽至西藏大學農(nóng)牧學院藏藥材種質資源圃栽培。于2014年1月、3月、5月、7月和9月分別從植物材料同一單株上采集根及根莖100 g,置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?種植物不同月份采集的根及根莖材料,分別等量混合后用于提取RNA。

1.2SSH文庫的構建

西藏八角蓮和桃兒七的根及根莖總RNA的提取,采用Fruit-mateTMfor RNA Purification(TaKaRa公司)和RNAiso Plus(TaKaRa公司)進行?？俁NA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測后進行下一步SSH文庫的構建工作。雙鏈cDNA的合成參照SMARTerTMPico PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech公司)說明書完成。以西藏八角蓮的cDNA為檢測樣品(tester),桃兒七的cDNA為參照樣品(driver),按PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit(Clontech公司)的說明書進行抑制差減雜交。SSH產(chǎn)物用MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa公司)純化后與pMDTM 18-T Vector連接過夜,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基除去未能轉化成功的大腸桿菌,采用藍白斑篩選陽性克隆。挑取白色克隆搖培過夜后,經(jīng)引物Nested PCR primer 1(5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′)和Nested PCR primer 2R(5′-AGCGTGGTC- GCGGCCGAGGT-3′)擴增后進一步鑒定陽性克隆。

1.3陽性克隆測序及序列分析

隨機選取文庫中201個具有唯一擴增條帶的陽性克隆,經(jīng)活化培養(yǎng)后,菌液用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa公司)提取質粒DNA,送上海瑞楚生物科技有限公司測序。測序得到的有效EST序列經(jīng)過Codoncode Aligner 4.0.4軟件的處理后,在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上進行比對分析,并進行功能注釋和歸類。

2結果與分析

2.1總RNA的質量檢測和抑制差減雜交效果分析

本研究中分別提取了西藏八角蓮與桃兒七根及根莖的RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。結果顯示總RNA樣品的28S、18S和5S條帶清晰,無明顯拖尾現(xiàn)象,說明提取的RNA完整性好,幾乎無降解。用紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度,結果表明,西藏八角蓮和桃兒七RNA樣品的OD260/280分別為1.99和2.02,OD260/230分別為2.00和2.01,RNA含量分別為1.90和1.63 μg/μL,說明提取的總RNA無降解,純度較高,無多糖和蛋白質污染,質量較好,符合建庫要求。

由圖2可以看出,進行兩輪雜交和兩輪PCR以后,富集了差異表達的基因,去除了共有的序列,因此彌散的cDNA片段數(shù)量減少,條帶亮度降低,差減以后cDNA片段整體向下偏移。說明差異表達基因得到了有效地富集和擴增,富集的差異表達片段集中在400～1 000 bp小片段范圍內(nèi)。

2.2SSH文庫的PCR鑒定

經(jīng)過37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h和4 ℃冰箱顯色4 h后,LB瓊脂平板上出現(xiàn)了明顯的藍色和白色菌落,依據(jù)藍白斑篩選的原理,對在含有氨芐青霉素平板上白色的菌落進行篩選、確認和編號,共發(fā)現(xiàn)有1 179個白色菌落和172個藍色菌落。本實驗得到的文庫重組率為87.3%,已達到構建文庫的重組率標準(80.0%)。

白色克隆經(jīng)菌落PCR擴增后,擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳圖(圖3)顯示插入片段呈隨機分布,長度集中在250～1 500 bp之間,平均大小在750 bp左右。有少數(shù)克隆無擴增條帶,無擴增條帶的克隆將再次采用PCR擴增核實。最后,確定出具有1個擴增條帶的克隆共951個,這些克隆所攜帶的cDNA信息即為本研究所得的cDNA基因文庫。

M.DL2000;1.西藏八角蓮根及

2.3EST測序分析

隨機選取文庫中201個陽性克隆進行測序,其中183個測序成功,達到91%。EST序列在Codo-ncode Aligner 4.0.4軟件上分析,去除接頭序列、載體序列、信號模糊的片段和低質量序列片段,剩余157條有效序列;聚類拼接得到unique ESTs共17個。通過同源比對和功能查詢,其中3個沒有同源匹配序列;2個為未知功能的假定蛋白,其余12個具有同源匹配序列。

由表1可以看出,有同源匹配序列的unique ESTs參與西藏八角蓮植物體內(nèi)的多種代謝反應,其中次生代謝類序列的比例最大,達到33.3%,其次是能量代謝、轉錄調控和光合作用類序列(16.7%),參與信號轉導、防御反應等過程的序列相對較少(8.3%)。亞麻木脂素脫氫酶、dirigent蛋白、松脂酚-落葉松脂醇還原酶和羧基甲基轉移酶是與鬼臼毒素生物合成相關的酶或蛋白。NADH脫氫酶F亞基、ATP合酶β亞基、1,5 -二磷酸核酮糖羧化酶和PSI III型葉綠素a/b結合蛋白是植物光合作用過程中光合電子傳遞和光合磷酸化所必需的酶復合體的組分。植物初生代謝通過光合作用、檸檬酸循環(huán)等途徑,為次生代謝提供能量和一些小分子化合物原料。MYB轉錄因子和WRKY轉錄因子參與植物的初生和次生代謝反應,在損傷、衰老、發(fā)育、代謝物質調節(jié)等方面都起到了重要的作用。無功能注釋和未匹配的unique ESTs可能屬于新的功能基因,需進一步研究了解其可能的功能。所有這些unique ESTs可能與西藏八角蓮與桃兒七根及根莖的鬼臼毒素含量存在差異有關。

M.DL1000;1.差減樣品第一輪PCR;2.未差減樣品第一輪PCR;

M.DL2000;1～24.SSH文庫中隨機挑取的白色克隆

EST編號ESTNo.同源基因片段編碼的蛋白(生物種)GeneproductofDNAhomology(Species)期望值E-value功能分類Functionalclassification1亞麻木脂素脫氫酶(桃兒七)Secoisolariciresinoldehydrogenase[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]5e-94次生代謝Secondarymetabolism4NADH脫氫酶亞基F基因;葉綠體(山荷葉屬)NADHdehydrogenasesubunitFgene;chloroplast(Diphylleiacymosa)8e-147能量代謝Energymetabolism5受體信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶(擬南芥)Receptorsignallingproteinserine/threoninekinase(Ara-bidopsisthaliana)4e-136信號轉導Signaltransduction7MYB轉錄因子(桃兒七)MYBtranscriptionfactor[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]1e-4轉錄Transcription8Dirigent蛋白(擬南芥)Dirigentprotein(Arabidopsisthaliana)4e-19次生代謝Secondarymetabolism9松脂酚-落葉松脂醇還原酶(亞麻屬)Pinoresinol-lariciresinolreductase(Linumalbum)2e-69次生代謝Secondarymetabolism10羧基甲基轉移酶(擬南芥)Carboxylmethyltransferase(Arabidopsisthaliana)3e-27次生代謝Secondarymetabolism111,5-二磷酸核酮糖羧化酶(山荷葉屬)Ribulose1,5-bisphosphatecarboxylase(Diphylleiacymosa)8e-85光合作用Photosynthesis13WRKY轉錄因子(桃兒七)WRKYtranscriptionfactor[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]6e-29轉錄Transcription14細胞色素P450(桃兒七)CytochromeP450[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]1e-09防御和應激反應Defenseandstressresponse16ATP合酶β亞基基因;葉綠體(山荷葉屬)ATPsynthasebetasubunitgene;chloroplast(Diphylleiacymosa)1e-104能量代謝Energymetabolism17PSⅠⅢ型葉綠素a/b結合蛋白(擬南芥)PSⅠtypeⅢchlorophylla/b-bindingprotein(Arabidopsisthaliana)8e-147光合作用Photosynthesis

3討論

西藏八角蓮和桃兒七是國家三級保護植物,在中國西藏東南部均有分布,其中西藏八角蓮為西藏特有的八角蓮屬植物種。其植株內(nèi)含量極微的具抗腫瘤和抗病毒活性的鬼臼類木脂素,具有很高的藥用價值。近年來的研究表明,桃兒七根及根莖的鬼臼毒素含量在4.0～67.0 mg/g[2,4-5,11]。與西藏八角蓮相關的此類研究較少,鐘國輝等[6]用HPLC法測定西藏八角蓮根及根莖的鬼臼毒素含量為0.2 mg/g。兩者的鬼臼毒素含量相差較大,這與用HPLC法測定鬼臼毒素含量的溶液濃度和色譜條件相關外,也表明鬼臼毒素合成能力在物種間與物種內(nèi)的變異、鬼臼毒素代謝對環(huán)境因子的響應與調控機制等問題都值得進一步研究揭示。

由于西藏八角蓮的自然分布具有顯著的地域局限性,對其鬼臼毒素代謝途徑的分子生物學研究較桃兒七晚十余年。至2016年1月10日,NCBI網(wǎng)站Genebank數(shù)據(jù)庫中西藏八角蓮只有34條DNA序列,而桃兒七的DNA序列達到35 607條。除開環(huán)異落葉松脂醇脫氫酶基因(DtSD)[24]和松脂醇合成酶基因(DtPS)[25]被克隆外,其他眾多功能基因尚未被克隆。鬼臼毒素來源植物遺傳信息的匱乏是限制鬼臼毒素生物合成途徑及其調控機制研究的重要原因。構建SSH文庫是發(fā)現(xiàn)差異表達基因,實施表達序列標簽(EST)測序計劃,進行功能基因研究較好的方法,目前已成功應用于植物中差異表達基因的研究。

本研究首次成功構建了西藏八角蓮與桃兒七根及根莖SSH文庫,獲得西藏八角蓮優(yōu)勢表達EST的克隆951個。隨機挑選201個克隆進行序列測定和分析,聚類拼接得到unique ESTs共17個,70.6%的unique ESTs有同源匹配序列,新序列出現(xiàn)的比例為29.4%。所以,本研究的EST數(shù)目只占SSH文庫EST總數(shù)的一小部分。雖然部分測序結果所獲得的信息不夠全面,但從這些有限的信息里可以大致了解這2種鬼臼類藥用植物根及根莖差異表達基因的生物學功能及表達豐度,并為后續(xù)開展西藏八角蓮代謝途徑功能基因的克隆和分析,以及發(fā)掘影響鬼臼類藥用植物鬼臼毒素合成能力的關鍵因子奠定了基礎。

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(編輯:宋亞珍)

Construction of Suppression Subtractive Hybridization Library from the Root and Rhizome ofDysosmatsayuensisYing

andSinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying YUAN Fang1,2,ZHEN Zijuan1,XU Yuanjiang1,LAN Xiaozhong1,2*

(1 Agriculture and Animal Husbandry College,Tibet University,Linzhi,Tibet 860000,China;2 TAAHC-SWU Medicinal Plants Joint Research and Development Center,Chongqing 400715,China)

Abstract:In order to screening podophyllotoxin biosynthesis related differentially express genes among podophyllin plant species,we constructed a suppression subtractive hybridization(SSH) library from root and rhizome of Dysosma tsayuensis Ying and Sinopodophyllum hexandrum (Royle) Ying.201 positive clones randomly picked from the SSH library were sequenced,and then 183 qualified sequence ESTs which represent 17 unique ESTs through pre-processing,assembling,clustering,annotation and functional classification from Dysosma tsayuensis were obtained.Among them,12 unique ESTs which annotated with database were further classified into functional groups including photosynthesis ,biosynthetic metabolism,transcriptional regulation,etc,accouted for 70.6%.5 unique ESTs were non-annotated or did not match any entry in the databases,accouted for 29.4%.These results showed that we successfully constructed a SSH library of Dysosma tsayuensis Ying and Sinopodophyllum hexandrum (Royle) Ying,which provided a foundation for revealing the podophyllotoxin biosynthetic pathway and its regulation mechanism.

Key words:Dysosma tsayuensis Ying;Sinopodophyllum hexandrum (Royle) Ying;SSH library;podophyllotoxin;EST

中圖分類號:Q785

文獻標志碼:A

作者簡介:袁芳(1983-),碩士,講師,主要從事藥用植物分子生物學研究。E-mail:yfsamantha-06@163.com*通信作者:蘭小中,博士,教授,主要從事藥用植物資源與開發(fā)利用。E-mail:lanxiaozhong@163.com

基金項目:西藏自然基金項目(2014019);西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心建設資助項目(2014-2015)

收稿日期:2015-12-06;修改稿收到日期:2016-02-01

文章編號:1000-4025(2016)03-0467-05

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0467