高效液相色譜—電化學(xué)法測(cè)定大鼠腦脊液中多巴胺含量的研究

黃小瑩++張黎君

摘 要：目的：研究高效液相色譜-電化學(xué)法測(cè)定大鼠腦脊液中多巴胺含量。方法：高效液相色譜運(yùn)用Waters Atlantis T3作為色譜柱，且將乙腈-緩沖液（20：80）作為流動(dòng)相，其pH=5.4，其相應(yīng)流速則為0.32 mL·min-1。就氟哌啶醇（第一代）和利培酮（第二代）相應(yīng)抗精神病藥，針對(duì)大鼠伏隔核（NAC）及前額葉皮層（mPFC）當(dāng)中多巴胺釋放所具有的影響予以比較分析。結(jié)果：mPFC中多巴胺含量當(dāng)給與氟哌啶醇之后，均未發(fā)生較大變化，而多巴胺在NAC當(dāng)中含量則出現(xiàn)明顯升高狀況；當(dāng)將利培酮給與之后，多巴胺含量在NAC及mPFC當(dāng)中均存在明顯升高狀況。結(jié)論：高效液相色譜-電化學(xué)法穩(wěn)定、靈敏及準(zhǔn)確，對(duì)于腦微透析樣品當(dāng)中相應(yīng)多巴胺具體的定量分析更為適用。就第二代抗精神病藥物（利培酮）而言，其可能利用將前額葉皮層相應(yīng)多巴胺水平予以升高方式，就認(rèn)知功能及陰性癥狀給與改善。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-電化學(xué)；大鼠腦脊液；多巴胺

中圖分類號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-8937（2016）12-0068-02

多巴胺最為人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中十分重要的神經(jīng)遞質(zhì)，而帕金森病及精神分裂癥發(fā)病因素則為腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)功能失調(diào)，為此，就準(zhǔn)確、靈敏及快速分析方法予以建立，并對(duì)其濃度予以測(cè)定，則對(duì)藥物治療、疾病診斷及神經(jīng)生理學(xué)研究均具有重要臨床意義[1]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究所選用試劑為甲酸和高氯酸、復(fù)方氯化鈉注射液、氟哌啶醇注射液、利培酮粉末、乙二胺四乙酸、無(wú)水檸檬酸、谷胱甘肽及鹽酸多巴胺等；所選用儀器為微透析探針和套管、Waters Atlantis T3色譜柱、腦立體定位儀、SCl-10A系統(tǒng)控制器、DGU-12A在線脫氣機(jī)、島津LC-20AD泵及手動(dòng)進(jìn)樣器等。所選動(dòng)物為雄性大鼠，平均體重為（259±19.8）g。

1.2 方 法

將所選取相應(yīng)透析樣品，經(jīng)量取出相應(yīng)20 μL，而后將其在存有200 μL PCR相應(yīng)離心管予以放入，而后將5 μL多巴胺穩(wěn)定劑加入，當(dāng)完成混勻后，運(yùn)用微量注射器實(shí)施取樣操作，劑量為20 μL。采用生理鹽水對(duì)氟哌啶醇注射液實(shí)施稀釋操作，且將其濃度調(diào)和至1 mg·mL-1；采用利培酮，且其中融入中性酒石酸0.1mol·L-1，實(shí)施熔解操作，而后將藥物溶液予以配置，其濃度則為1mg·mL-1。

此外，選取14只SD雄性大鼠，將其依據(jù)隨機(jī)方式劃分為三組，各為利培酮組、氟哌啶醇組及空白組。首先麻醉大鼠，并就腦區(qū)mPFC給與定位，此外，還需將NAC給與定位，而后將探針引導(dǎo)管埋置于腦區(qū)內(nèi)，且于清醒動(dòng)物裝置中將大鼠予以妥善放置，當(dāng)于區(qū)間3～5 d恢復(fù)后，在大鼠皮下，將給藥管予以埋置，將插入探針及B030802均插于引導(dǎo)管處，在針入口處，將微量注射泵予以接入，而于出口處，則將接樣管實(shí)施接入操作，且對(duì)灌流速度予以控制，即為1.4 μL·min-1。采用Ringer's實(shí)施液灌流操作，當(dāng)完成2 h平衡之后，各于30 min，將1份透析液給與收集，且基礎(chǔ)值則為3樣品，當(dāng)完成皮下注射且給藥之后，對(duì)其中3 h樣品給與收集，并采用上述方法實(shí)施樣品檢測(cè)[2-3]。

2 結(jié) 果

2.1 線性關(guān)系考察

就多巴胺儲(chǔ)備液給與精密量取，而后采用高氯酸溶液 0.1 mol·L-1，將其與100 nmol·L-1實(shí)施結(jié)合稀釋操作，而后采用Ringer's液，將上述溶液分別給與0.2、0.5、2、5及20 nmol·L-1等稀釋操作，并依據(jù)上述檢測(cè)方法實(shí)施檢測(cè)。當(dāng)縱坐標(biāo)為測(cè)物峰面積Y，且橫坐標(biāo)為待測(cè)物濃度X，則運(yùn)用加權(quán)（1/X2）最小二乘法，開展回歸運(yùn)算操作[4]，便可將標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)回歸方程予以得出：

Y=1.977×105X-1.401×104（r=0.9997）

而多巴胺則于0.2～20 nmol·L-1之間，具有良好的線性關(guān)系，依據(jù)信噪比S/N=3，就檢測(cè)限予以計(jì)算，則為0.05 nmol·L-1；依據(jù)S/N=10，對(duì)定量限給與計(jì)算，則為0.1 nmol·L-1。

2.2 精密度與回收率

依據(jù)上述配置方法，分別就濃度劃分為低、中及高且各為0.5、2.0及10.0nmol·L-1相應(yīng)質(zhì)控溶液予以配置，且需各自配置5份，其依據(jù)上述操作步驟，實(shí)施5次日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣操作，且連續(xù)3d實(shí)施日間測(cè)定，依據(jù)相應(yīng)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，將各個(gè)質(zhì)控樣品所具有濃度予以求出，且將日間及日內(nèi)相應(yīng)精密度進(jìn)行計(jì)算，就樣品相應(yīng)回收率予以計(jì)算，見表1。

2.3 大鼠mPFC及NAC中利培酮及氟哌啶醇對(duì)其內(nèi)多巴 胺釋放影響分析

依據(jù)上述操作方法，于大鼠皮下，分別將RISP及HAL各為1mg·kg-1，分別于前后順序就NAC及mPFC當(dāng)中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在具體的透析液當(dāng)中所存在的多巴胺水平，所存在的相應(yīng)變化率，如圖1所示。

從中可知，mPFC中多巴胺含量當(dāng)給與氟哌啶醇之后，均未發(fā)生較大變化，而多巴胺在NAC當(dāng)中含量則出現(xiàn)明顯升高狀況（1.6倍）；當(dāng)將利培酮給與之后，多巴胺含量在NAC及mPFC當(dāng)中均存在明顯升高狀況，及分別為后者的2.5倍及1.6倍。

3 討 論

多巴胺作為一種極性較強(qiáng)的物質(zhì)，通常情況下，其反相色譜柱，對(duì)其具有較弱的保留行為，所以，通過(guò)對(duì)Wasters Atlantis T3色譜柱給與選擇，具有較好的分離效果。此外，在Ringer's溶液當(dāng)中，多巴胺存在不穩(wěn)定狀況，而在本次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，將抗氧劑加入至多巴胺 Ringer's溶液之后，對(duì)其進(jìn)行觀察可知，多巴胺具有較好的穩(wěn)定性。針對(duì)流動(dòng)相中水相而言，其相比于有機(jī)相比例，則對(duì)于多巴胺峰位具有較為顯著的影響，伴隨水相比例相應(yīng)升高狀況，則多巴胺在具體峰位方面則會(huì)出現(xiàn)向后移動(dòng)狀況，此外，其還對(duì)雜質(zhì)峰具有較小的影響。就流動(dòng)相的pH而言，其也會(huì)影響于樣品峰的位置。特別是一些相應(yīng)雜質(zhì)峰所具有的峰位，則其具有較大的影響[5]。如若pH>4.3，則在具體的腦透析液當(dāng)中，雜峰就會(huì)出現(xiàn)于多巴胺峰附近，對(duì)測(cè)定形成干擾。如若其值處于小于4.3或之下狀況，則該峰則會(huì)出現(xiàn)快速前移狀況，而多巴胺峰峰位則變化不明顯，在有效分離方面可實(shí)現(xiàn)。精神分裂癥的發(fā)病，往往和中腦邊緣系統(tǒng)當(dāng)中，相應(yīng)多巴胺在具體的功能方面出現(xiàn)紊亂，存在相關(guān)性，而對(duì)于精神分裂癥狀況下所存在的認(rèn)知障礙及陰性癥狀，則和mPFC在多巴胺功能方面出現(xiàn)不足相關(guān)。

通過(guò)本次研究可知，利培酮（非典型抗精神病藥），對(duì)于mPFC當(dāng)中多巴胺相應(yīng)釋放具有明顯增加狀況，可能和其能夠?qū)φJ(rèn)知障礙及陰性癥狀予以改善相應(yīng)機(jī)制有關(guān)，而氟哌啶醇則無(wú)法達(dá)到此功效。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 張向暉，劉軍，蘇林雁.庫(kù)侖陣列電化學(xué)高效液相色譜法測(cè)定大鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2007，（1）.

[5] 譚炳炎，鄭琳，馮翔.高效液相色譜/電化學(xué)法測(cè)定大鼠血液和腦組織中單胺類物質(zhì)的含量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2006，（2）.