利用聚丙烯酸鈉-Nafion混合膜增強(qiáng)三聯(lián)吡啶釕摻雜SiO2納米粒的電化學(xué)發(fā)光信號及其生物標(biāo)記

陳 哲， 豆興茹,2， 葛芝莉， 郭莉萍， 謝洪平*

(1. 蘇州大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123； 2. 蘇州大學(xué) 第一附屬醫(yī)院， 江蘇 蘇州 215123；3. 重慶科技學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 重慶 401331)

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利用聚丙烯酸鈉-Nafion混合膜增強(qiáng)三聯(lián)吡啶釕摻雜SiO2納米粒的電化學(xué)發(fā)光信號及其生物標(biāo)記

陳 哲1， 豆興茹1,2， 葛芝莉1， 郭莉萍3， 謝洪平1*

(1. 蘇州大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123； 2. 蘇州大學(xué) 第一附屬醫(yī)院， 江蘇 蘇州 215123；3. 重慶科技學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 重慶 401331)

對于三聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)32+)摻雜的SiO2納米粒，以聚電解質(zhì)聚丙烯酸鈉和成膜物質(zhì)Nafion的混合液對納米粒進(jìn)行包覆，制備了聚丙烯酸鈉和Nafion混合膜包覆的電化學(xué)發(fā)光(ECL)納米粒。結(jié)果表明：混合膜包覆的納米粒，相對于Nafion膜的ECL信號增強(qiáng)了13倍。同時，混合膜表面可交換陽離子顯著增加，能夠通過離子交換固載大量的Ru(bpy)32+，納米粒的ECL信號可進(jìn)一步增強(qiáng)約3倍?；旌夏み€具有另外一個顯著的優(yōu)勢，即通過混合膜的疏水相互作用可以方便地標(biāo)記生物大分子，標(biāo)記抗體仍然具有良好的免疫活性。

信號增強(qiáng)； 電化學(xué)發(fā)光納米粒； 聚丙烯酸鈉； Nafion混合膜； 生物標(biāo)記

1 引 言

三聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)32+)是目前研究最為廣泛的電化學(xué)發(fā)光(ECL)活性物質(zhì)，然而，它本身沒有可用于標(biāo)記的活潑基團(tuán)，常常通過衍生化或以納米粒為載體而實現(xiàn)標(biāo)記。SiO2納米粒良好的生物相容性和大量的帶負(fù)電荷的微通道使其可以通過摻雜的方法固載大量的三聯(lián)吡啶釕，實現(xiàn)ECL信號的放大，提高ECL分析的靈敏度[1-5]。為了實現(xiàn)生物標(biāo)記，SiO2納米粒需要進(jìn)行表面功能化。然而，由于三聯(lián)吡啶釕良好的水溶性，無論直接摻雜還是以超分子包合物摻雜[6]，三聯(lián)吡啶釕在表面功能化時均易于從納米粒中泄漏。全氟化樹脂Nafion是一種聚陰離子疏水聚合物，易于在納米粒表面成膜。一些研究者[7-11]在非摻雜的SiO2納米粒表面包覆Nafion膜，通過膜表面的陽離子交換將Ru(bpy)32+固載于納米粒上，再利用膜的疏水性區(qū)域，通過疏水相互作用即可方便地標(biāo)記生物大分子。但是，在該類ECL納米粒中，SiO2納米粒子僅僅是Nafion膜的載體，并沒有直接固載Ru(bpy)32+于納米粒的微孔中。

若將Nafion膜包覆在Ru(bpy)32+摻雜的SiO2納米粒(Ru@SiO2)表面，則制備得到的納米粒(Ru@SiO2/Nafion)既有摻雜于內(nèi)部的Ru(bpy)32+，又可以利用離子交換固載Ru(bpy)32+于納米粒表面，固載量將會極大地增加。然而，ECL信號并未顯著增強(qiáng)。究其原因，Nafion膜的疏水性結(jié)構(gòu)阻礙了摻雜于內(nèi)部的電活性物質(zhì)與電極之間的電化學(xué)接觸，阻礙了電子轉(zhuǎn)移，使摻雜的Ru(bpy)32+的ECL信號顯著減弱。本文以陰離子聚電解質(zhì)聚丙烯酸鈉(PAA-Na)和Nafion的混合液對摻雜納米粒Ru@SiO2進(jìn)行包覆，制備了混合膜包覆的復(fù)合納米粒(Ru@SiO2/PAA-Nafion)。相對于Nafion膜，混合膜既有效地克服了電子轉(zhuǎn)移阻礙的問題，又增加了膜表面Ru(bpy)32+的固載量，同時，混合膜的疏水性區(qū)域仍然能夠通過疏水相互作用方便地標(biāo)記生物大分子。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

Ru(bpy)3Cl2·6H2O(>98.0%)購于百靈威科技有限公司；Nafion(5%質(zhì)量分?jǐn)?shù))和聚丙烯酸鈉(PAA-Na,45%質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Mw=8 000)購于Sigma-Aldrich公司；兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG-FITC及牛血清白蛋白(BSA)購于生工生物工程(上海)有限公司；正硅酸乙酯(TEOS，AR)和其他化學(xué)試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為自制三蒸去離子水。

實驗儀器包括：NICOMPTM380ZLS Zeta電位及粒度分析儀(美國PSS公司)；MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測儀(西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司)；RST5000系列電化學(xué)工作站(蘇州瑞思特儀器有限公司)。

2.2 摻雜納米粒的制備

在恒溫40 ℃水浴磁力攪拌的25 mL無水乙醇中加入0.75 mL的 TEOS，再向其中加入150 μL Ru(bpy)32+溶液(25 mmol/L)與350 μL水的混合溶液，磁力攪拌0.5 h后加入1 mL NH4OH，繼續(xù)磁力攪拌1 h，再加入0.5 mL TEOS，繼續(xù)攪拌3 h后停止反應(yīng)。高速離心，棄上清，沉淀先后用無水乙醇和三蒸水超聲復(fù)溶后高速離心洗滌2次，最后復(fù)溶于25 mL三蒸水中，得濃度為18 mg/mL的 Ru(bpy)32+摻雜的SiO2納米粒溶液，即Ru@SiO2溶液。

2.3 混合膜包覆納米粒的制備

取濃度為18 mg/mL的 Ru@SiO2溶液2 mL高速離心，沉淀復(fù)溶于5 mL無水乙醇中，向其中緩慢地加入500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的Nafion與500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的 PAA-Na的混合液，在冰浴下磁力攪拌4 h后停止反應(yīng)。高速離心，棄上清，沉淀用三蒸水超聲，復(fù)溶，高速離心，沉淀再復(fù)溶于2 mL三蒸水中，得濃度為18 mg/mL的PAA-Na與Nafion混合膜包覆的Ru@SiO2納米粒溶液，即Ru@SiO2/PAA-Nafion溶液。

2.4 混合膜包覆納米粒的抗體標(biāo)記

2.5 檢測樣本與ECL檢測

所檢測的ECL物質(zhì)或納米粒均溶于1 mL濃度為0.01mol/L 的PBS(pH=7.4)中，再加入1 mL TPA溶液(TPA 濃度為0.05 mol/L，溶劑為濃度為0.3 mol/L、pH=6.8的PBS緩沖液)，混合均勻，備用。ECL檢測條件為：掃描電位0～1.4 V；電流靈敏度1×10-4A；掃描速率0.1 V/s；光電倍增管高壓600 V，放大級數(shù)3。

3 結(jié)果與討論

3.1 ECL納米粒的粒徑分布

對于Ru(bpy)32+摻雜的SiO2納米粒，以其為核心載體進(jìn)行膜的包裹及生物連接。由粒徑分布圖(圖1)可知，粒徑分布均勻，平均粒徑約為110 nm，表明已成功制備了摻雜的ECL納米粒。

圖1 摻雜納米粒的粒徑分布

Fig.1 Particle size distribution of the doped nanoparticles

3.2 混合膜對摻雜Ru(bpy)32+的ECL增強(qiáng)

PAA-Na為陰離子型聚電解質(zhì)，在溶液中能夠表現(xiàn)出強(qiáng)導(dǎo)電性。這種陰離子型聚電解質(zhì)與部分磺酸化Nafion(即陰離子型Nafion)的混合液具有兩方面的優(yōu)勢：第一，在溶液中由于電荷相同而避免了聚沉；第二，借助Nafion的良好成膜性，能夠?qū)⒕垭娊赓|(zhì)大分子固定于膜中，使兩者混合成膜，而混合膜中的聚電解質(zhì)所具有的強(qiáng)電子轉(zhuǎn)移能力，可望解決Nafion膜對摻雜Ru(bpy)32+與電極之間電子轉(zhuǎn)移阻礙的問題。我們以相同量的Ru@SiO2納米粒子，在相同條件下分別包覆Nafion膜和混合膜，相應(yīng)的ECL強(qiáng)度卻表現(xiàn)出了明顯的差異(圖2)?？梢园l(fā)現(xiàn)，相對于純的Nafion膜，混合膜包覆的Ru@SiO2納米粒的ECL信號獲得了極大的增強(qiáng)，后者是前者的13倍。結(jié)果表明，混合膜中的聚電解質(zhì)PAA-Na有助于摻雜于內(nèi)部的電活性物質(zhì)與電極之間的電子轉(zhuǎn)移，使摻雜的Ru(bpy)32+的ECL信號顯著地增強(qiáng)。

圖2 Ru@SiO2/PAA-Nafion (a)和Ru@SiO2/Nafion (b)納米粒的ECL

Fig.2 ECL of Ru@SiO2/PAA-Nafion(a) and Ru@SiO2/Nafion (b)

3.3 混合膜的生物標(biāo)記及其標(biāo)記抗體的免疫反應(yīng)性能

Nafion膜通過其疏水性骨架與生物分子結(jié)合而實現(xiàn)生物標(biāo)記[10-11]，預(yù)示著本文所制備的Ru@SiO2/PAA-Nafion納米粒也能夠據(jù)此實現(xiàn)生物標(biāo)記，我們選用第二抗體兔抗小鼠IgG(m-IgG)作為研究的模型生物大分子。為了表征被納米粒標(biāo)記的m-IgG的生物反應(yīng)活性，即免疫反應(yīng)性能，我們利用了熒光物質(zhì)FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(r-IgG-FITC)能夠與納米粒標(biāo)記的m-IgG發(fā)生免疫反應(yīng)的特性，形成了免疫復(fù)合物[Ru@SiO2/PAA-Nafion]-m-IgG—r-IgG-FITC。由于在免疫復(fù)合物m-IgG—r-IgG的兩個抗體上分別標(biāo)記有納米粒和FITC，而ECL納米粒本身也是熒光體，因此，可以用這兩種熒光體表征被納米粒標(biāo)記抗體m-IgG的生物反應(yīng)活性。

用相同量的納米粒標(biāo)記不同量的m-IgG樣本2份，經(jīng)過量的BSA封蔽，使標(biāo)記了抗體的納米粒表面能夠發(fā)生疏水相互作用的所有位點均被完全封蔽，再與相同量的、過量的r-IgG-FITC發(fā)生免疫反應(yīng)，離心分離，復(fù)溶于PBS(pH=7.4)，即獲得了免疫復(fù)合物，相應(yīng)的熒光光譜如圖3所示。從圖3可知，來自于納米粒的熒光強(qiáng)度(601 nm)基本相同，表明兩個免疫復(fù)合物樣本中納米粒的數(shù)量是基本一致的。在同一樣本中同時出現(xiàn)了納米粒和FITC(517 nm)的熒光，表明納米粒標(biāo)記的抗體m-IgG能夠與FITC標(biāo)記的抗體r-IgG發(fā)生免疫反應(yīng)，形成了免疫復(fù)合物；并且隨著納米粒中加入抗體m-IgG量的增加，F(xiàn)ITC的熒光也在增強(qiáng)，即免疫復(fù)合物的量在增加，表明納米粒表面結(jié)合的抗體m-IgG量也在增加。結(jié)果表明，混合膜包覆的ECL納米粒能夠標(biāo)記大量的抗體，標(biāo)記的抗體具有良好的免疫反應(yīng)活性。

圖3r-IgG-FITC與ECL納米粒標(biāo)記的50 μg/mL(a)或10 μg/mL(b)m-IgG的免疫復(fù)合物熒光光譜

Fig.3 Fluorescence spectra of the immune complexes betweenr-IgG-FITC and 50 μg/mL (a) or 10 μg/mL (b)m-IgG labeled by the ECL nanoparticles

3.4 混合膜對納米粒離子交換能力的影響及其ECL信號增強(qiáng)自于陰離子型Nafion和摻雜在混合膜中的陰離子聚電解質(zhì)PAA-Na，并且后者聚電解質(zhì)具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于前者的可交換陽離子，預(yù)示著本文制備的混合膜包覆納米粒利用陽離子交換可以固載大量的Ru(bpy)32+，實現(xiàn)納米粒ECL信號的進(jìn)一步增強(qiáng)。為了消除摻雜于納米粒內(nèi)部的Ru(bpy)32+所產(chǎn)生的ECL信號對陽離子交換而固載的Ru(bpy)32+的信號干擾，我們以非摻雜的SiO2納米粒進(jìn)行混合膜包覆，以考察混合膜對納米粒離子交換能力的影響及其對ECL信號的增強(qiáng)，如圖4所示。由圖4可知，相對于Nafion膜包覆SiO2制備的ECL納米粒，混合膜的ECL強(qiáng)度增加了約3倍，表明混合膜顯著地增強(qiáng)了納米粒的離子交換能力，進(jìn)而增強(qiáng)了納米粒的ECL信號。

在ECL納米粒Ru@SiO2/PAA-Nafion表面包覆的混合膜上存在兩類可交換的陽離子，分別來自于陰離子型Nafion 和摻雜在混合膜中的陰離 子聚電解質(zhì)PAA-Na，并且后者聚電解質(zhì)具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于前者的可交換陽離子，預(yù)示著本文制備的混合膜包覆納米粒利用陽離子交換可以固載大量的Ru(bpy)32+，實現(xiàn)納米粒ECL 信號的進(jìn)一步增強(qiáng)。為了消除摻雜于納米粒內(nèi)部的Ru(bpy)32+所產(chǎn)生的ECL 信號對陽離子交換而固載的Ru(bpy)32+的信號干擾，我們以非摻雜的SiO2 納米粒進(jìn)行混合膜包覆，以考察混合膜對納米粒離子交換能力的影響及其對ECL 信號的增強(qiáng)，如圖4 所示。由圖4 可知，相對于Nafion 膜包覆SiO2制備的ECL 納米粒，混合膜的ECL 強(qiáng)度增加了約3 倍，表明混合膜顯著地增強(qiáng)了納米粒的離子交 換能力，進(jìn)而增強(qiáng)了納米粒的ECL 信號。

Fig.4 混合膜(a)和Nafion膜(b)包覆SiO2納米粒固載Ru(bpy)32+的ECL
Fig.4 ECL of Ru(bpy)32+immobilized by the mixing membrane (a) and Nafion membrane (b) covered nanoparticles

4 結(jié) 論

以陰離子聚電解質(zhì)PAA-Na與成膜物質(zhì)陰離子型Nafion的混合液包覆Ru(bpy)32+摻雜的SiO2納米粒，制備了ECL納米粒Ru@SiO2/PAA-Nafion。相對于單純的Nafion膜包覆納米粒，混合膜表面既有大量的疏水性區(qū)域，也存在大量的被膜固載的聚電解質(zhì)大分子，表現(xiàn)出了三方面的顯著優(yōu)勢：第一，極大地減小了電極對摻雜于納米粒內(nèi)部的電活性物質(zhì)Ru(bpy)32+的電化學(xué)發(fā)光激發(fā)的阻礙，增強(qiáng)了ECL的電子轉(zhuǎn)移能力，使ECL強(qiáng)度增加了13倍；第二，基于離子交換固載Ru(bpy)32+于納米粒表面的能力獲得了顯著的增強(qiáng)，相應(yīng)的ECL強(qiáng)度增加了約3倍；第三，基于疏水相互作用能夠方便地、大量地標(biāo)記抗體，并且被標(biāo)記的抗體仍具有良好的免疫反應(yīng)活性。

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Electrochemiluminescence Signal Enhancement of Ru(bpy)32+-doped SiO2Nanoparticles Based on Sodium Polyacrylate-Nafion Mixing Membrane and Their Bio-labeling

CHEN Zhe1, DOU Xing-ru1,2, GE Zhi-li1, GUO Li-ping3, XIE Hong-ping1*
(1.CollegeofPharmaceuticalSciences，SoochowUniversity，Suzhou215123，China；2.FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215123，China；3.CollegeofChemistryandChemicalEngineering，ChongqingUniversityofScienceandTechnology，Chongqing401331，China)
*CorrespondingAuthor,E-mail:hpxie@suda.edu.cn

Ru(bpy)32+-doped SiO2nanoparticles were covered with the mixture of polyelectrolyte sodium polyacrylate and membrane-forming substance Nafion, and then the electrochemiluminescence (ECL) nanoparticles were acquired. The results show that ECL intensity of the polyacrylate-Nafion mixing membrane covered nanoparticles is enhanced 13 times, compared with the Nafion membrane covered nanoparticles. At the same time, there is an obvious increase of the exchangeable cation on the surface of the mixing membrane, and more Ru(bpy)32+can be immobilized on the surface of the nanoparticles based on ion exchanging, and the corresponding ECL intensity can be enhanced about 3 times. Another significant advantage of the mixing membrane is that the as-prepared nanoparticles can label bio-macromolecule more easily based on the hydrophobic interaction. The results show that the labelled antibody still has good immune activity.

signal enhancement; electrochemiluminescence nanoparticles; sodium polyacrylate; Nafion-mixing membrane; bio-labelling

陳哲(1989-)，男，山西運城人，碩士研究生，2013年于蘇州大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事藥物分析與藥物質(zhì)量控制方面的研究。

E-mail: 276088360@qq.com

謝洪平(1964-),男，四川西充人，博士，教授，2002年于湖南大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事藥物分析與藥物質(zhì)量控制方面的研究。

E-mail: hpxie@suda.edu.cn

1000-7032(2016)03-0310-05

2015-10-16；

2015-12-21

O482.31; O614.82

A

10.3788/fgxb20163703.0310