鋱離子增敏熒光光度法測(cè)定魚(yú)肉組織中的恩諾沙星殘留

任乃林+李紅

摘要： 為了研究建立分析測(cè)定恩諾沙星的新方法，以鋱-恩諾沙星配合物的熒光特性為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)在pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖溶液中，鋱與恩諾沙星的配合物在545 nm（λex=328 nm）處產(chǎn)生了Tb3+的特征熒光峰，可用于恩諾沙星的分析測(cè)定，從而建立了簡(jiǎn)單、快速、靈敏測(cè)定恩諾沙星的熒光方法，并優(yōu)選了反應(yīng)的最佳條件。在最佳試驗(yàn)條件下，恩諾沙星濃度在1.0×10-8～1.0×10-6 g/mL范圍內(nèi)與其545 nm的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系（r2=0.992 3），檢出限為1.3×10-9 g/mL；對(duì)藥片中恩諾沙星的測(cè)定回收率為97.7%，變異系數(shù)為1.4%；對(duì)于魚(yú)肉組織中恩諾沙星測(cè)定回收率為79.0%～94.5%，變異系數(shù)為2.0%～7.8%。

關(guān)鍵詞： 增敏熒光分光光度法；恩諾沙星；鋱（Ⅲ）；藥片；魚(yú)肉殘留檢測(cè)；新方法

中圖分類號(hào)： S912 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0294-03

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）別稱乙基環(huán)丙沙星，是第3代氟喹諾酮類抗菌藥，為動(dòng)物專用抗菌素，因具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、生物利用度高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)而受到國(guó)內(nèi)外臨床獸醫(yī)的關(guān)注，在臨床上已被廣泛應(yīng)用。恩諾沙星為廣譜抗菌藥，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏桿菌、嗜血桿菌、巴氏桿菌等革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抗菌作用[1]；此外，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌亦表現(xiàn)出良好的抗菌作用。恩諾沙星主要用于治療豬、雞、鵝、牛等的細(xì)菌性感染，同時(shí)用于治療繼發(fā)性感染和豬、雞的霉形體病。但是長(zhǎng)期用藥所產(chǎn)生的不良反應(yīng)、在畜禽產(chǎn)品中的殘留、耐藥性的增加以及在環(huán)境中的生態(tài)效應(yīng)等已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注，農(nóng)業(yè)部也制定了相關(guān)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于恩諾沙星的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2-6]、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9-10]、化學(xué)發(fā)光分析法[11-12]和熒光光譜法[13]等。

從化學(xué)結(jié)構(gòu)看，恩諾沙星藥物與其同類藥物類似，其核心部分為喹啉，具有較大的共軛結(jié)構(gòu)和剛性平面結(jié)構(gòu)，因此可產(chǎn)生較顯著的熒光，適合采用熒光光度法測(cè)定。

稀土離子Tb3+是靈敏的熒光探針，被廣泛用于藥物、蛋白質(zhì)、核酸等測(cè)定和研究，利用稀土Tb3+作為熒光探針測(cè)定喹諾酮類藥物已見(jiàn)報(bào)道[14-16]，如周靜等研究了鋱-培氟沙星的熒光特性[16]。本研究主要探討了ENR與Tb3+離子配合物體系的熒光特性，發(fā)現(xiàn)ENR與Tb3+離子能形成穩(wěn)定的配合物，能夠發(fā)射鋱離子的特征譜線[16]，由此建立1種簡(jiǎn)單、快速、可靠的檢測(cè)藥物中恩諾沙星含量的方法，并用于實(shí)際樣品魚(yú)肉組織中恩諾沙星殘留的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

RF-5301型熒光分光光度計(jì)（日本島津分析儀器公司）；pHS-3D型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

主要試劑有：恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用適量蒸餾水溶解，配成濃度為 1.0 mg/mL 貯備液；2 mol/L HAc溶液；HAc-NaAc緩沖溶液：取50 mL 2 mol/LHAc溶液用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至所需pH值，定容至100 mL；Tb3+標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 mmol/L）：準(zhǔn)確稱取Tb4O7粉末0.373 8 g于燒杯中，逐漸加入適量的濃鹽酸，用電熱套加熱，保持微沸使其溶解，溶解后繼續(xù)加熱至蒸發(fā)結(jié)晶，再用0.1mol/L稀鹽酸溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容，用時(shí)稀釋到所需濃度。

熒光測(cè)定均在室溫進(jìn)行，所有化學(xué)試劑除特別注明外均為分析純?cè)噭?，試?yàn)用水為2次蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

在10 mL的比色管中，分別加入適量的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再依次加入一定量的20 mmol/L Tb3+溶液、1.0 mL HAc-NaAc 緩沖溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL，振蕩均勻后放置20 min。

熒光光度法的測(cè)定：在室溫條件下，用1 cm石英比色皿裝入測(cè)量溶液，置于RF-5301型熒光分光光度計(jì)中，分別進(jìn)行熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜掃描 （激發(fā)狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為350～700 nm），確定測(cè)定體系的最大熒光激發(fā)波長(zhǎng)、最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)。試驗(yàn)中采用固定激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)的方法測(cè)定相應(yīng)條件下測(cè)試溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

片劑中恩諾沙星的測(cè)定：取2片恩諾沙星片劑樣品（規(guī)格為0.1 g ∶ 5 mg），精確稱量后研細(xì)，準(zhǔn)確稱取1片量的藥粉，用蒸餾水溶解，待藥物完全溶解后過(guò)濾不溶物，將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容。取適量在最佳試驗(yàn)條件下測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度，計(jì)算恩諾沙星含量。

魚(yú)肉樣品中恩諾沙星的測(cè)定：隨機(jī)于市場(chǎng)購(gòu)置多寶魚(yú)、鯽魚(yú)、羅非魚(yú)樣品，去鱗、內(nèi)臟組織，取其食用部分絞碎混勻。準(zhǔn)確稱取5.00 g混勻魚(yú)肌肉組織樣，加入5.0 g無(wú)水硫酸鈉研磨均勻后置于10 mL離心管中，加入提取溶劑 （4 mL乙腈、0.04 mL 冰乙酸 ），高速勻漿2 min，于3 000 r/min離心6 min，移取上層清液；將殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并上層清液，用氮?dú)獯蹈?，再?.0 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖液溶解殘?jiān)?，并稀釋?5.00 mL，取6份2.0 mL該樣品液，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)ENR溶液，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定其中的ENR含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

準(zhǔn)確量取10 μL濃度為1 mg/mL的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL比色管中，加入1 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。可以看出：恩諾沙星的最大激發(fā)波長(zhǎng)為328 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為435 nm。

在上述體系中加入Tb3+，恩諾沙星的激發(fā)光譜明顯下降（圖1中B線）；同時(shí)由于配合物的形成，發(fā)生分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移，435 nm處恩諾沙星本身的熒光發(fā)射峰降低，同時(shí)在489、545、582、620 nm出現(xiàn)Tb3+的特征發(fā)射峰（圖1中B1線）。為了后續(xù)的研究，本試驗(yàn)中如果選擇激發(fā)波長(zhǎng)為275 nm時(shí)，在發(fā)射光譜550 nm附近會(huì)出現(xiàn)倍頻峰，將對(duì)Tb3+在545 nm附近的特征峰形成干擾，因此最后選擇激發(fā)波長(zhǎng)為328 nm。

2.2 酸度對(duì)ENR-Tb（Ⅲ）熒光強(qiáng)度的影響

在pH值為3.5～13.0的HAc-NaAc緩沖溶液中，觀察ENR-Tb3+配合物的熒光光譜變化。結(jié)果表明，在強(qiáng)堿性環(huán)境下（pH值>10）及強(qiáng)酸性環(huán)境下（pH值<3.5），ENR與Tb3+配合物不穩(wěn)定，沒(méi)有Tb3+的熒光發(fā)射；pH值為3.5～9.0范圍內(nèi)，均可觀察到Tb3+的熒光發(fā)射，545 nm的熒光強(qiáng)度隨pH值的變化情況見(jiàn)圖2；當(dāng)pH值=6.0時(shí)，能得到最為明顯的鋱離子的特征峰，545nm的熒光強(qiáng)度最大，試驗(yàn)選用的 HAc-NaAc緩沖溶液pH值=6.0作為配合物形成最佳酸堿度。

2.3 Tb3+濃度對(duì)鋱離子的特征熒光強(qiáng)度的影響

本試驗(yàn)固定ENR的濃度為1.0 μg/mL，HAc-NaAc緩沖溶液的pH值=6.0，通過(guò)改變鋱離子的濃度，觀察其熒光光譜的變化。從結(jié)果看出，隨著鋱離子濃度增加，在545 nm處鋱離子的特征熒光強(qiáng)度逐漸增大（圖3）；當(dāng)Tb3+濃度為 125 mg/L 時(shí)，545 nm鋱離子的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，說(shuō)明在此條件下，能量轉(zhuǎn)移最好，因此后續(xù)試驗(yàn)中固定Tb3+濃度為 125 mg/L。

2.4 線性范圍和檢出限

在最佳試驗(yàn)條件下，配制ENR的系列溶液，按相應(yīng)試驗(yàn)方法分別測(cè)定在545 nm處的熒光強(qiáng)度。ENR濃度在1.0×10-8～1.0×10-6 g/mL范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為F=264.29C+27.586，r2=0.992 3[F為熒光強(qiáng)度；C為ENR濃度，mg/L]。在最佳條件下平行測(cè)定11次空白溶液，按國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）（3σ）規(guī)定的方法計(jì)算檢出限為1.3×10-9g/mL。對(duì)于5.0×10-8 g/mL的ENR溶液進(jìn)行10次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%。

2.5 樣品測(cè)定

2.5.1 片劑中恩諾沙星的測(cè)定 取適量該樣品液并用“1.2”節(jié)方法平行測(cè)定5次，代入線性方程，計(jì)算得每片恩諾沙星平均含量為4.9 mg，結(jié)果與標(biāo)示量基本相符（表1）。

2.5.2 恩諾沙星的回收率 在3支盛有樣品液的10 mL比色管中分別加入1.0 mg/mL恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液，然后再加入1 mL pH值為6.0的HAc-NaAc緩沖液，再加入1.25 mL 1.0 mg/mL Tb3+溶液，按試驗(yàn)方法分別測(cè)定在545 nm處的熒光強(qiáng)度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，平均回收率為97.7%。

2.5.3 魚(yú)肉樣品的分析 按“1.2”節(jié)方法對(duì)魚(yú)肉樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，本次抽取的魚(yú)肉樣品均未檢出ENR殘留。試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。方法的平均回收率在79.0%～94.5%之間，變異系數(shù)在10%以內(nèi)，達(dá)到了國(guó)際殘留法規(guī)委員會(huì)的要求。

3 結(jié)論

恩諾沙星與Tb3+能形成配合物發(fā)射鋱離子的特征熒光，由此建立了1個(gè)測(cè)定ENR的新方法，本方法用于實(shí)際樣品（恩諾沙星片劑和魚(yú)肉組織）中ENR的測(cè)定，方法快速，操作簡(jiǎn)便，樣品回收率均在70%以上，變異系數(shù)在10%以內(nèi)，達(dá)到了國(guó)際殘留法規(guī)委員會(huì)的要求，可作為檢測(cè)ENR殘留的快速篩選方法。

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