禽類受精過程中的精卵互作

摘 要：受精是有性生殖動物繁育下一代必不可少的過程。在過去數(shù)十年中，我們對哺乳動物精卵互作分子機制的理解已取得重要進展。然而，由于禽類的卵子較大和模擬發(fā)生在正常受精過程中的生理性多精受精過程有一定困難，我們在禽類精卵互作方面積累的知識并未達到類似于在哺乳動物上積累的水平。本文將總結(jié)目前人們對禽類受精過程中精卵互作機制的理解，尤其著重總結(jié)精卵結(jié)合、精子的頂體反應(yīng)以及卵周膜通道形成所必需的真精子蛋白酶；解釋卵周膜中透明帶（Zona Pellucida，ZP）蛋白（ZP1和ZP3）在精卵結(jié)合、頂體反應(yīng)誘導(dǎo)以及精子蛋白酶消化作用下的精子滲透作用。我們期望：對鳥類受精過程的更深刻理解，能夠為家禽行業(yè)中包括生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因或克隆禽類在內(nèi)的眾多應(yīng)用開發(fā)強有力工具開辟新的途徑。

關(guān)鍵詞：頂體反應(yīng)；受精；卵周膜；精卵互作；精子蛋白酶

中圖分類號：S831.3 文獻標(biāo)識碼：C 文章編號：1001-0769（2016）12-0027-05

在任何有性生殖的動物中，受精是繁殖后代必不可少的過程?？傮w而言，受精是一個按時序逐步發(fā)生的重要生理過程，包括精卵物種特異性的結(jié)合、頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)、精子滲透進入卵子以及配子的融合。大量研究表明：透明帶（包圍在哺乳動物卵子周圍的卵膜）在受精過程中精卵互作的第一步上起著重要作用。當(dāng)精子接觸到卵子時，它們必須先穿過透明帶，然后才能進行精卵融合。盡管我們尚未完全理解受精過程中這些生理活動的分子機制，但研究人員從利用如轉(zhuǎn)基因和基因敲除等反向遺傳技術(shù)的研究中，已找到了哺乳動物中調(diào)控受精過程的大量證據(jù)和關(guān)鍵作用分子。

與哺乳動物相比，禽類的卵子特別大，這導(dǎo)致我們無法在體外通過直接觀察禽類的精卵互作來研究這個過程。舉例來說，至今還未有可行的禽類體外受精（in vitro Fertilization，IVF）方法，研究人員只好將分離的卵周膜（哺乳動物透明帶的類似物）與采集的精子進行體外培養(yǎng)作為體外受精的替代模型。此外，由于系帶層（也稱為卵黃膜外層，由輸卵管漏斗部分泌）會在排卵后會迅速覆蓋在卵周膜表面，排出的卵子很快會失去受精能力。隨后，精子將不再與這些卵子互作，而被阻留在系帶層或卵清蛋白中。盡管存在這些困難，但包括我們實驗室在內(nèi)的多個研究小組使用家養(yǎng)禽類（主要是雞和鵪鶉）研究了禽類受精的機制。

本文我們將總結(jié)人們對禽類受精過程中精卵互作機制的最新認識，特別是對精卵結(jié)合、精子頂體反應(yīng)以及卵周膜孔形成所必需的真精子蛋白酶。

1 精卵結(jié)合

精卵結(jié)合是受精過程的第一步。1980年，Wassarman研究小組在小鼠上確定了3種透明帶蛋白ZP1、ZP2和ZP3，并發(fā)現(xiàn)ZP3負責(zé)（小鼠）物種特異性的精卵結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，隨后研究人員也在很多動物的卵膜中鑒定出了精卵結(jié)合所必需的ZP蛋白。盡管ZP蛋白的結(jié)構(gòu)和功能在進化上比較保守，但有趣的是不同動物的ZP蛋白來源卻不相同。例如，小鼠的3種ZP蛋白是在不斷發(fā)育的卵細胞中合成，而兔的ZP3蛋白則產(chǎn)生于卵巢顆粒細胞。在一些卵生動物（例如魚和鳥類）中，一些卵外膜蛋白由肝臟分泌，并經(jīng)血液循環(huán)運輸至卵巢；不過，在非洲爪蟾中，卵細胞則是ZP蛋白的唯一來源。

我們之前報道了鵪鶉的卵周膜至少由5種蛋白組成（ZP1、ZP2、ZP3、ZP4和ZPD）。正如前言中所提及的，禽類無體外受精系統(tǒng)，一般以離體卵周膜作為研究精卵互作機制的替代途徑（圖1）。利用這個系統(tǒng)，我們曾報道了純化的鵪鶉ZP3蛋白的特異性抗血清在日本鵪鶉上能有效阻止精子穿透卵周膜。對于這一抑制現(xiàn)象，有3種可能的解釋：（1） 抗血清覆蓋了ZP3蛋白（精子的一個結(jié)合位點），從而阻止了精卵結(jié)合；（2） 抗血清阻止了精子的頂體反應(yīng)；（3） 抗血清抑制了消化卵周膜的蛋白酶的作用。盡管我們沒有進行進一步的試驗，但Bausek等通過測試純化的ZP1或ZP3蛋白與精子的結(jié)合，證明了兩種ZP蛋白均能特異性地結(jié)合到精子頭部的頂端。然而，在雞上，僅ZP3蛋白能能夠通過與分子量為180 kDa的精子蛋白產(chǎn)生互作而發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。這些結(jié)果表明ZP3蛋白是雞和鵪鶉卵周膜上的精子結(jié)合蛋白，不過具體的精卵結(jié)合機制仍不清楚。在小鼠中，有報道稱ZP2蛋白也有助于精子結(jié)合；ZP2蛋白被卵巢皮質(zhì)顆粒蛋白酶的有限消化會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性改變，這能防止多精受精。在禽類中，ZP2蛋白表達于未成熟卵泡的卵細胞中，并作為一種微量組分存在于卵周膜中。前不久，Nishio及其同事證明了雞的ZP2蛋白在未成熟的卵細胞包被層中累積，并駐留在成熟卵子的胚盤區(qū)。盡管ZP2蛋白與精子的結(jié)合特性尚未進行測試，但研究雞中報道的ZP2蛋白位置是否與精子穿透卵子更多地發(fā)生在胚盤區(qū)的這種現(xiàn)象相關(guān)將會十分令人關(guān)注。要證明禽類中的精卵結(jié)合分子機制還需進一步的研究。

正如前文所述，ZP蛋白在精卵結(jié)合過程中起著重要作用。然而，禽類中負責(zé)精卵互作的輔助分子，包括在精子表面與ZP蛋白互作的活性組分仍有待研究。為此，我們制備了抗鵪鶉精細胞膜組分的單克隆抗體（Monoclonal Antibody，MAB）庫，并在體外通過精子檢測了MAB庫（成員）抑制卵周膜孔形成的能力。在MAB庫的上浮物中，我們發(fā)現(xiàn)上浮物19A16A13能強有力地阻止卵周膜孔的形成。對抗原使用串聯(lián)質(zhì)譜分析表明MAB能識別精子頂體素（精子頭粒蛋白）。免疫組化分析和超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)精子頂體素位于精子細胞質(zhì)膜和頂體基質(zhì)中。事實表明，MAB確能有效地阻止有完整頂體的精子與卵周膜結(jié)合。盡管精子頂體素ZP蛋白的結(jié)合能力還未知，但這些研究結(jié)果表明在鵪鶉受精過程中，精子質(zhì)膜上分子量為45 kDa的精子頂體素有助于精子與卵周膜結(jié)合。

2 精子的頂體反應(yīng)

某些組分，通過精子的細胞質(zhì)膜和頂體外膜的融合，精子會釋放出頭部頂端的頂體泡內(nèi)含物，此過程被稱為頂體反應(yīng)（Acrosome Reaction，AR）。頂體反應(yīng)使頂體內(nèi)膜（Inner Acrosomal Membranes，IAM）暴露，IAM內(nèi)的蛋白質(zhì)如IZUMO 1蛋白被激活。不同動物頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)物不同。在海膽類生物中，當(dāng)精子到達卵子外基膜（膠膜）時發(fā)生頂體反應(yīng)，膠質(zhì)中的海藻糖硫酸酯聚合物作為頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)物。在海星中，糖蛋白（頂體反應(yīng)誘導(dǎo)物：Acrosome Reaction-Inducing Substance，ARIS）和甾體皂苷（ARIS輔助因子）的混合物或由34個氨基酸殘基組成的多肽Asterosap，均具有誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的潛能。類似的，非洲爪蟾輸卵管直段分泌的分子量為300 kDa的糖蛋白ARISX已被證實為其頂體反應(yīng)誘導(dǎo)物，在小鼠和人中，孕酮具有誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)的功能。人們普遍認為，頂體反應(yīng)對釋放頂體基質(zhì)內(nèi)含物非常重要，釋放的精子頂體素能消化卵膜，形成便于精子穿透的通道。然而，最近多項研究發(fā)現(xiàn)，小鼠中大多數(shù)精子在到達透明帶前已完成頂體反應(yīng)，且已經(jīng)進入卵周隙的精子具有再次穿透透明帶的能力。從這些觀察結(jié)果來看，很顯然我們需要重新思考之前對哺乳動物受精過程中頂體反應(yīng)作用的認識。

在禽類中，研究發(fā)現(xiàn)精子頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)活性發(fā)生在卵周膜中。雞卵周膜中的N-連接寡糖和末端N-乙酰葡萄糖胺殘基掌控著頂體反應(yīng)誘導(dǎo)活性的證據(jù)來自十多年前的研究報道。然而，卵周膜中何種成分才是真正起作用的頂體反應(yīng)誘導(dǎo)物，這在所有禽類中仍然未知。為了鑒定日本鵪鶉卵周膜中頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)物，我們建立了一種在顯微鏡下從頂體完整的精子中辨別發(fā)生頂體反應(yīng)的精子的方法。由于煙酸己可堿（Hoechst）33342染色負性結(jié)構(gòu)定位于精子核頂端，鵪鶉精子頂體可清晰地被檢測到（圖2）。通過這個方法，我們發(fā)現(xiàn)日本鵪鶉中卵周膜ZP1蛋白具有誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的活性，同時我們也證實了附著于ZP1蛋白上的N-連接寡糖在驅(qū)動頂體反應(yīng)中起著重要的作用。與我們的研究結(jié)果相一致的是，Okumura及同事發(fā)現(xiàn)當(dāng)采集的精子用純化的ZP1或ZPD蛋白（雞卵周膜中另一微量組分）共培養(yǎng)時，頂體反應(yīng)可誘導(dǎo)發(fā)生。這些結(jié)果使我們確信禽類精子頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)發(fā)生在卵周膜表面，這與小鼠中的情況不同。

從介導(dǎo)頂體反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面來看，研究表明哺乳動物精子的Gi蛋白參與此過程，因為百日咳毒素（Pertussis Toxin，PTX，Gi蛋白功能抑制劑），會抑制哺乳動物精子中ZP蛋白誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)。很有意思的是，有研究報道PTX并不會抑制人和小鼠精子中由孕酮誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)以及小鼠中乙酰膽堿誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)，這其實是一種PTX不敏感受體參與了頂體反應(yīng)誘導(dǎo)過程。這些資料提示不同的生理刺激可利用不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)，不過雙重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)存在的生理重要性仍有待解析。我們之前對日本鵪鶉的研究顯示，當(dāng)PTX被加入培養(yǎng)混合物中時，ZP1和A23187蛋白誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)均受到明顯的抑制。這些結(jié)果表明ZP1或A23187蛋白可能通過Gi蛋白介導(dǎo)機制起作用，這類似于哺乳動物精子中透明帶啟動的精子頂體反應(yīng)。

3 負責(zé)消化卵周膜的蛋白酶

雖然以上機制仍存在爭議，但人們普遍認為精子攜帶的蛋白酶能水解卵子外膜，由此蛋白酶形成的小孔為精子穿透提供通道。另外，人們長期以來一直認為：哺乳動物中的精子頂體素（即位于精子頭部的非ATP依賴性絲氨酸蛋白酶）在精子的穿透過程中是必不可少的。然而，Baba等的研究證明敲除頂體素的雄性小鼠仍能產(chǎn)生活動能力正常且具授精能力的精子。因此，至少對小鼠而言，精子頂體素對受精并不是必需的。目前，頂體素可以被認為負責(zé)分散頂體反應(yīng)中精子頂體內(nèi)含物。Sawada等報道在海生無脊椎動物如海鞘、海膽中，精子蛋白酶體負責(zé)精子穿透卵質(zhì)膜。蛋白酶體是一種被稱為細胞溶解酶的溶解劑，它對溶解卵子外基質(zhì)是不可或缺的。相似的結(jié)論可在小鼠、豬及人等哺乳動物的受精過程中獲得。

在禽類中，受精發(fā)生在輸卵管的漏斗部，在受精時僅卵周膜包裹著卵子。如上所述，禽類精卵互作是可以在體外依照精子在卵周膜上形成小孔的能力進行估量。通過抑制頂體反應(yīng)，添加PTX，我們發(fā)現(xiàn)位于精子質(zhì)膜上分子量為45 kDa的頂體素負責(zé)精子與卵子卵周膜的結(jié)合，但它對卵周膜糖蛋白的消化并不重要。這些結(jié)果表明：在禽類受精過程中真正起作用的細胞溶解酶不是頂體素，而是存在于精子中的另一蛋白酶。為了鑒定真正的禽類細胞溶解酶，我們之前曾檢測了精子蛋白酶體在日本鵪鶉受精過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨血液循環(huán)的ZP1蛋白在運輸至卵周膜過程中得到了某些修飾。這是從以下試驗獲得的結(jié)論：在對從產(chǎn)蛋鵪鶉血清中獲得的ZP1蛋白進行純化后，將其經(jīng)靜脈注入不同禽類，外源性ZP1蛋白信號可以在卵周膜中檢測到。然而從卵周膜分離的ZP1蛋白還能不能進入到卵周膜。如前文所提到的，卵膜蛋白ZP1是禽類真正的頂體反應(yīng)誘導(dǎo)物。我們也測試了血清ZP1蛋白是否也能誘導(dǎo)日本鵪鶉的頂體反應(yīng)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種ZP1蛋白均能誘導(dǎo)頂體反應(yīng)，但免疫印記分析表明抗泛素抗體只與卵周膜ZP1蛋白互作。這些結(jié)果表明血清ZP1蛋白在運輸過程中在細胞外受到泛素化作用，同時與ZP3蛋白結(jié)合并在卵周膜上形成不溶性纖維（圖3）。當(dāng)血清ZP1蛋白或卵周膜ZP1蛋白在與精子共培養(yǎng)時，我們再次發(fā)現(xiàn)僅卵周膜ZP1蛋白被水解為小段肽鏈。利用抗20S蛋白酶體抗體的蛋白印跡（Western Blot，WB）分析和超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性蛋白酶體位于精子的頂體區(qū)域。在培養(yǎng)混合物中添加特定的蛋白酶體抑制劑MG132，或通過添加三磷酸腺苷雙磷酸酶使細胞外ATP耗盡，均能有效抑制精子在卵周膜的穿透。這些結(jié)果清晰地證明了精子蛋白酶體在禽類受精中的重要作用以及ZP1的細胞外泛素化可能發(fā)生在經(jīng)血液循環(huán)的運輸過程中（圖3）。盡管我們有很多研究證據(jù)顯示泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對鵪鶉精子受精中在卵周膜上孔形成和之后精子穿透起卵周膜著重要的作用（圖4），但頂體素（即頂體絲氨酸蛋白酶）仍被確信為參與了受精過程中卵周膜孔的形成。正如在大多動物中研究所揭示的，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在動物受精中的作用可能是普遍保守的。其中，禽類泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是研究受精過程中精子蛋白酶作用的有利模型，因為禽類精子能在卵周膜上形成一個較大的孔，且大量的靶蛋白ZP1可以從較大的卵子分離到。

大多數(shù)動物排出的卵子只接收一個精子形成合子，因為卵子內(nèi)有一個阻斷系統(tǒng)以防止多精進入。最近對小鼠進行的研究發(fā)現(xiàn)，卵皮質(zhì)顆粒蛋白酶Ovastatin對阻擋多精入卵是必不可少的；Ovastatin能部分水解ZP2蛋白，因而精子不會再與經(jīng)Ovastatin修飾的透明帶互作。以非洲爪蟾的受精為例，當(dāng)?shù)谝粋€精子進入卵子后不久，卵子質(zhì)膜會迅速發(fā)生改變，通過誘發(fā)正向受精能力，來防止第二個精子的融合，以此迅速阻止多精入卵。與這些單精受精系統(tǒng)相比，禽類的卵子在受精過程中可以接受很多精子并進行多精受精。

這種生理情況表明在禽類受精過程中沒有阻止多精入卵的分子機制。我們最近在鵪鶉上利用胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（Intra-Cytplasmic Sperm Injection，ICSI）證實了禽類多精受精是必要的，因為禽類較大的卵子需要更多能夠負責(zé)激活卵子和之后胚胎發(fā)育的精子?？梢院侠砑僭O(shè)：缺乏阻止多精入卵的機制且需要大量精子因子激活大型卵子的這兩種現(xiàn)象是禽類在進化中獲得的能力。

4 結(jié)論

本文中我們介紹了近年來關(guān)于禽類精卵互作的研究成果。哺乳動物和禽類受精系統(tǒng)的比較如圖5所示。多種調(diào)控禽類受精的重要分子已被找到，但這主要是參照哺乳動物的研究而獲得的。因目前尚無通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因操作禽類的有效方法，有關(guān)禽類受精機制的知識還非常有限。我們最近的研究顯示利用ICSI技術(shù)能成功孵化出健康的小雞。用ICSI技術(shù)成功獲得健康雞對家禽業(yè)、農(nóng)業(yè)及禽類保護（包括轉(zhuǎn)禽基因、克隆技術(shù)以及保護瀕危禽類）都有巨大的意義。結(jié)合ICSI技術(shù)和現(xiàn)代技術(shù)如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，我們預(yù)期在不久的將來通過ICSI技術(shù)我們將能夠生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因禽和基因敲除禽。我們也希望ICSI技術(shù)能幫助于我們了解禽類受精作用和胚胎發(fā)育機制的機制以及禽類生物學(xué)其他領(lǐng)域的知識。

原題名：Sperm-Egg Interaction during Fertilization in Birds（英文）

原作者：Yoshinobu Ichikawa、Mei Matsuzakil、Gen Hiyama、Shusei Mizushima和Tomohiro Sasanamil