抗茶樹(shù)白星病MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆和生物信息學(xué)分析

摘 要 白星病是貴州省茶葉生產(chǎn)的重要限制因素。提高貴州省茶葉品種的抗病性，對(duì)促進(jìn)貴州省茶葉產(chǎn)量提高、品質(zhì)改善具有重大的戰(zhàn)略和現(xiàn)實(shí)意義。初步分析表明：茶葉CsMYBantif為MYB類轉(zhuǎn)錄因子，受白星病菌侵染以及旱處理、鹽處理等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。該基因是茶樹(shù)遺傳資源改良的重要候選基因。下一步需要揭示該基因響應(yīng)白星病菌侵染的分子機(jī)理，為培育抗白星病茶樹(shù)新品種或新種質(zhì)儲(chǔ)備基因資源。

關(guān)鍵詞 茶樹(shù)；白星?。晦D(zhuǎn)錄因子；CsMYBantif

中圖分類號(hào)：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.35.038

我國(guó)是世界上最大的茶葉生產(chǎn)國(guó)，也是重要的茶葉貿(mào)易國(guó)，茶葉產(chǎn)業(yè)在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。茶白星病在我國(guó)安徽、福建、貴州、四川、江西、湖南和云南等茶葉產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。茶樹(shù)感染白星病后，新梢生長(zhǎng)不良、芽重減輕、葉片易脫落，發(fā)病茶園一般減產(chǎn)10%左右，病重茶園減產(chǎn)50%以上，甚至片葉無(wú)收，該病已發(fā)展成為我國(guó)茶葉高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要限制因素之一。

培育和大范圍應(yīng)用高抗白星病茶葉品種是遏制白星病病害、提高茶園效益的重要途徑。借助于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段與常規(guī)育種有機(jī)結(jié)合應(yīng)該是破解茶葉抗白星病育種難題的新的出路。而目前，茶葉抗白星病轉(zhuǎn)基因育種的一個(gè)瓶頸是缺乏有效的抗性基因。對(duì)茶葉白星病抗性進(jìn)行分子機(jī)理研究，克隆茶葉抗白星病相關(guān)基因，研究其致病/抗病機(jī)制是茶葉抗病育種的基礎(chǔ)和前提。

目前，茶葉抗白星病的研究還集中在生理和田間病害發(fā)生調(diào)查方面，白星病菌侵染茶樹(shù)的分子機(jī)理研究還十分薄弱。曾明森研究表明，茶白星病菌以菌絲體或分生孢子器的形式在茶樹(shù)病葉、病梢及落葉中越冬。次年春天，茶樹(shù)幼葉初展時(shí)期，白星病菌的分生孢子器便會(huì)釋放出大量分生孢子，通過(guò)風(fēng)雨傳播，在濕度適宜時(shí)侵入幼嫩芽葉、新梢致病。經(jīng)2～5 d潛伏期，茶樹(shù)幼嫩新葉上便會(huì)表現(xiàn)出病斑，病斑上又會(huì)產(chǎn)生分生孢子再侵染，使病害不斷擴(kuò)展蔓延。若外界條件適宜，此病害便會(huì)大范圍的流行。

茶葉白星病屬低溫高濕型病害，當(dāng)平均溫度約為20 ℃，相對(duì)濕度達(dá)80%時(shí)，最利于白星病害發(fā)生。在適合發(fā)病的季節(jié)，若連續(xù)3～5 d陰雨，白星病便會(huì)爆發(fā)。此病發(fā)生期早，流行時(shí)間長(zhǎng)。一般發(fā)生始期為3月下旬，流行期從4月上旬至6月上旬。貴州省高山茶園由于多霧、陰濕、低溫，故白星病發(fā)生尤其頻繁，為害劇烈。

克隆茶葉抗病基因，研究其抗病機(jī)制是茶葉抗白星病育種的基礎(chǔ)和前提。在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中，植物自身已經(jīng)發(fā)展了多種通過(guò)調(diào)節(jié)自身生理和代謝變化來(lái)抵御病菌侵染的機(jī)制。其中的一個(gè)重要機(jī)制就是通過(guò)病菌侵染信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)啟動(dòng)抗病響應(yīng)基因的表達(dá)。在病菌侵染信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，轉(zhuǎn)錄因子由于能夠調(diào)節(jié)多個(gè)響應(yīng)功能基因的表達(dá)而備受關(guān)注。在擬南芥基因組已發(fā)現(xiàn)1 600多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，約為基因總數(shù)的6%。MYB轉(zhuǎn)錄因子是其中數(shù)目最多的一類。MYB基因家族參與植物的各種發(fā)育生理過(guò)程，如器官形態(tài)建成、細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)、次生代謝、生物和非生物脅迫應(yīng)答以及ABA的敏感性等。

本研究利用茶樹(shù)已有的基因組序列信息，從貴州優(yōu)良、特異品種遵義毛峰中克隆到一個(gè)新的MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMYBantif。實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)CsMYBantif基因可能在茶葉生物和非生物脅迫反應(yīng)中起重要調(diào)控作用，是茶樹(shù)抗逆性遺傳改良的重要候選基因。因此，有必要研究清楚CsMYBantif轉(zhuǎn)錄因子的功能及其在白星病菌脅迫響應(yīng)中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為茶樹(shù)的抗病育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 CsMYBantif基因克隆

將遵義毛峰幼苗種于花盆中，在25 ℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)一致幼苗的根、莖、葉，用于不同組織的表達(dá)特性分析；選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，取幼嫩葉片部位用于RNA提取和表達(dá)分析。利用Trizol（Invitrogen）法提取根、莖和葉組織的總RNA，利用定量PCR分析CsMYBantif的時(shí)空表達(dá)特性。

1.2 CsMYBantif生物信息學(xué)分析

基因序列克隆后，利用orf finder找出對(duì)應(yīng)氨基酸序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建使用MEGA6.0軟件。基因序列的結(jié)構(gòu)分析使用在線軟件GSDS（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）。氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征分析使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線工具。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉CsMYBantif基因克隆

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，在遵義毛峰cDNA中擴(kuò)增出目的基因片段，如圖1所示，條帶大小在900～1 000 bp?？寺y(cè)序后顯示該基因編碼序列（Coding sequence，CDS）為696 bp，可編碼231個(gè)氨基酸，所編碼氨基酸序列的序列為：MAPRVNFPQRTRTQFLPSSGVKRRMPSPPQVSASSESSDGFPPEPPMAAANGKRRREVEEEVNGADSGHRTQGLRELAQAIRRFGEVYERVELAKREQELRMERDRLEAARELEDQRVQFFLKMQMELSKANNAGASAAAAAVGAVATAIAAADGNGTRRTAMATDVGTSSNHHVRYRFKDSRHCHAAPQQPQHQYNENNAAEAARGTGNGSDTDNKEDEDEAEDEEDESQ。

2.2 CsMYBantif響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫

選取生長(zhǎng)一致的幼苗，分別進(jìn)行培養(yǎng)液（CK）、PEG、NaCl、白星病菌侵染、4 ℃低溫及H202處理后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CsMYBantif在茶樹(shù)葉片中的表達(dá)變化情況，如圖2所示。結(jié)果表明，在白星病菌液侵染后，CsMYBantif在葉中的表達(dá)較對(duì)照極顯著增強(qiáng)，為對(duì)照的45倍（P<0.000 1），而在PEG、NaCl、低溫和H202處理后，CsMYBantif在葉中的表達(dá)與對(duì)照相比也有明顯增加，說(shuō)明在葉中響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫方面，CsMYBantif具有重要的功能。

3 結(jié)論

茶白星病是貴州省茶葉生產(chǎn)的重要限制因素。茶樹(shù)感染白星病后，產(chǎn)量會(huì)嚴(yán)重減少，質(zhì)量急劇下降。茶白星病是我國(guó)茶葉高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要限制因素。本文利用茶樹(shù)已有的基因組序列信息，從貴州優(yōu)良、特異品種遵義毛峰中克隆到一個(gè)新的MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMYBantif。實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)CsMYBantif基因在白星病菌侵染后表達(dá)顯著上調(diào)，可能在茶葉生物和非生物脅迫反應(yīng)中起重要調(diào)控作用，是茶樹(shù)抗逆性遺傳改良的重要候選基因。

下一步有必要研究清楚CsMYBantif轉(zhuǎn)錄因子的功能及其在白星病菌脅迫響應(yīng)中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為茶樹(shù)的抗病育種提供基因資源。

（責(zé)任編輯：劉昀）