飼料污染物嘔吐毒素對單胃動物家禽和豬腸道的影響（續(xù)）

上期回顧：上一期介紹了豬禽對嘔吐毒素毒性的易感性，嘔吐毒素對腸道上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，對生理黏膜防御的影響，對腸道形態(tài)完整性的影響。

中圖分類號：S852 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：1001-0769（2016）04-0091-03

2.4 嘔吐毒素對營養(yǎng)素腸道吸收的影響

在飼喂嘔吐毒素污染飼料的雞中首次觀察到D-葡萄糖等多種關(guān)鍵營養(yǎng)素的腸道轉(zhuǎn)運和攝取受到影響，這種影響也與動物生長速度較差有關(guān)。不過，嘔吐毒素對體內(nèi)營養(yǎng)素吸收的影響知之甚少。我們是首個建立體外方法以研究嘔吐毒素對營養(yǎng)素轉(zhuǎn)運和攝取的影響以及利用尤斯灌流室技術(shù)研究分離的雞腸道黏膜電生理特性的團(tuán)隊之一。我們通過測定攝入不同劑量的嘔吐毒素或不同暴露時間的雞分離的腸道組織的短路電流（Isc）、跨上皮離子電導(dǎo)（Gt）或跨膜電阻（TEER）對離子轉(zhuǎn)運、腸道屏障完整性和功能來進(jìn)行評估。總體而言，該研究表明，加入D-葡萄糖或L-脯氨酸后提高了Isc，而在攝入嘔吐毒素的家禽中該指標(biāo)降低（表1），這表明嘔吐毒素改變了葡萄糖或L-脯氨酸誘導(dǎo)的Isc，進(jìn)而使得腸道中Na+共轉(zhuǎn)運系統(tǒng)受到抑制。這些研究結(jié)果以及后續(xù)研究結(jié)果表明，抑制Na+轉(zhuǎn)運和Na+-D-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運是嘔吐毒素對家禽腸道細(xì)胞毒性的一部分。

使用相同的體外技術(shù)，我們還發(fā)現(xiàn)用嘔吐毒素對黏膜部位進(jìn)行處理（10 μg/mL），可降低葡萄糖的攝取，其效果幾乎與鈉依賴性葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運載體（SGLT-1）的特異性抑制劑——根皮苷相當(dāng)。后來有研究也報告豬攝入嘔吐毒素（4 μg/mL和 8 μg/mL）后，空腸黏膜對葡萄糖和丙氨酸的吸收受到抑制。雞體內(nèi)嘔吐毒素暴露試驗結(jié)果確認(rèn)，人體腸道細(xì)胞株HT-29-D4暴露于嘔吐毒素下后，對葡萄糖和L-絲氨酸的吸收下降。

文獻(xiàn)提出的嘔吐毒素可減少腸道對營養(yǎng)素吸收的主要假設(shè)，是其能夠下調(diào)腸細(xì)胞關(guān)鍵營養(yǎng)素轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的能力。越來越多的證據(jù)表明，嘔吐毒素可改變多種參與雞關(guān)鍵營養(yǎng)素吸收的轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)，如十二指腸和空腸組織中葡萄糖鈉轉(zhuǎn)運蛋白1（SGLT-1）以及十二指腸組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2（GLUT-2，表2）。使用定量基因表達(dá)方法也發(fā)現(xiàn)，飼喂污染嘔吐毒素的日糧（每千克飼料含嘔吐毒素1 mg、2.5 mg或5 mg，23 d），可以下調(diào)編碼多種營養(yǎng)素轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵基因。例如，負(fù)責(zé)糖（葡萄糖和果糖）、多種氨基酸（D-絲氨酸和其他中性氨基酸）、棕櫚酸（主要的飼料長鏈脂肪酸）和單羧酸鹽（短鏈脂肪酸）攝入和運輸?shù)腟LC2A5、SLC7A10、SLC27A4 和SLC16A1基因表達(dá)分別出現(xiàn)下降。即使在利用腸上皮細(xì)胞株HT-29-D4進(jìn)行的人體研究中，攝入嘔吐毒素會抑制D-葡萄糖/D-半乳糖 SGLT-1轉(zhuǎn)運蛋白、D-果糖被動轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-5和主動及被動L-絲氨酸轉(zhuǎn)運蛋白等腸道轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)。作者推測，由嘔吐毒素引發(fā)的SGLT-1抑制主要是因為嘔吐毒素能夠抑制蛋白質(zhì)的合成。這一假設(shè)在一項由Awad和Zentek （2014）利用雞進(jìn)行的最新研究中得到了證實。這些作者評估了在尤斯室條件下作為蛋白質(zhì)合成抑制劑——放線酮（CHX）及嘔吐毒素對腸道營養(yǎng)素吸收的影響。有意思的是，研究發(fā)現(xiàn)在用嘔吐毒素或CHX處理的腸道組織中，葡萄糖和谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運抑制差不多，這顯示它們抑制雞腸道細(xì)胞中各自蛋白質(zhì)合成的能力相當(dāng)。

綜上所述，現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明，嘔吐毒素能夠通過改變負(fù)責(zé)相應(yīng)轉(zhuǎn)運蛋白合成的營養(yǎng)素轉(zhuǎn)運基因的表達(dá)來影響營養(yǎng)素的吸收（表2）。從臨床來看，嘔吐毒素暴露引起的糖和氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白受抑制可能不僅會導(dǎo)致小腸對能量和營養(yǎng)素攝取的下降，而且更為重要的是，這種影響可能由于大量未消化的糖和氨基酸在后腸大量發(fā)酵而造成腸道功能失調(diào)。后腸內(nèi)此類底物供應(yīng)的增加可能會破壞腸道微生物的生態(tài)平衡，造成菌群失調(diào)及后續(xù)的發(fā)酵性腹瀉、腸病、脫水和食欲不振。

2.5 嘔吐毒素對腸道通透性的影響

跨上皮離子電導(dǎo)（Transepithelial Ion Conductance，Gt）或跨膜電阻（Transepithelial Electrical Resistance，TEER）的改變是腸道屏障功能、腸內(nèi)離子細(xì)胞間轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)以及豬和雞腸道細(xì)胞完整性受到破壞的標(biāo)志。利用豬腸道表皮細(xì)胞株IPEC-1和IPEC-J2進(jìn)行的研究也表明，接觸嘔吐毒素后TEER發(fā)生了變化（表3）。同樣，嘔吐毒素亦可降低雞空腸和十二指腸的TEER。在豬腸道中也觀察到嘔吐毒素以劑量依賴型方式對TEER產(chǎn)生類似的降低效果，表明腸道屏障遭到破壞，細(xì)胞旁通透性增加。

此外，一項離體和體外研究發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素可提高豬腸道FITC-葡聚糖的細(xì)胞旁通路，表明腸道屏障功能受到重大損傷以及機(jī)體健康出現(xiàn)嚴(yán)重的后果。實際上，由嘔吐毒素引發(fā)的豬腸道通透性提高，使豬腸細(xì)胞系（即IPEC-J2）中的共生菌以及典型的革蘭氏陰性致病菌（GNB）——鼠傷寒沙門氏菌——跨上皮通過成為可能。研究發(fā)現(xiàn)，以每千克飼料含2.85 mg嘔吐毒素的劑量喂豬5周，可導(dǎo)致豬空腸claudin-4表達(dá)下降。Claudins是一種重要的細(xì)胞與細(xì)胞間的緊密連接蛋白，在腸道上皮完整性方面起著重要的作用，這是首次在豬中直接證明嘔吐毒素對緊密連接蛋白的影響。

2.6 嘔吐毒素對緊密連接蛋白表達(dá)及其mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

體外（30 μmoL/L，24 h） 及體內(nèi)研究（2.85 mg/kg，5 周）首次發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素可改變豬腸道緊密連接蛋白的表達(dá)（表4）。Diesing等（2011）使用免疫印跡測定法觀察到，在IPEC-J2細(xì)胞株（4 000 ng/mL， 24 h、48 h和72 h）中緊密連接蛋白claudin-3顯著減少。這些發(fā)現(xiàn)在最近利用豬進(jìn)行的體內(nèi)研究中得到了證實：飼喂嘔吐毒素（3 mg/kg飼料）35 d，能使粘附型連接蛋白E-cadherin和腸道中另一種緊密連接蛋白如封閉蛋白的表達(dá)下降。在暴露于嘔吐毒素中的Caco-2細(xì)胞中也觀察到claudin-4蛋白的生物合成下降。表4匯總了連接蛋白表達(dá)對嘔吐毒素暴露的應(yīng)答情況。然而，盡管該研究結(jié)果均支持嘔吐毒素具有降低緊密連接蛋白的效果，但在雞中進(jìn)行的一項研究中觀察到嘔吐毒素暴露對緊密連接蛋白完全相反的作用。在該研究中，嘔吐毒素飼喂3周，發(fā)現(xiàn)嘔吐毒素與雞空腸組織中claudin-5緊密連接蛋白的mRNA表達(dá)上調(diào)相關(guān)，而對claudin-1、閉合蛋白帶1（zona occludens-1）和2的mRNA的表達(dá)無顯著影響。這些結(jié)果表明，雞飼料中的嘔吐毒素（7.54 mg/kg飼料）會選擇性作用于腸細(xì)胞緊密連接復(fù)合體的不同部位。這是迄今為止首個也是唯一的雞體內(nèi)研究文獻(xiàn)。作者認(rèn)為claudin-5 mRNA上調(diào)與TLR4 mRNA上調(diào)有關(guān)，表明是GNB引起的腸道上皮炎癥。此外，嘔吐毒素改變了腸道壁的形態(tài)，并上調(diào)了氧化應(yīng)激蛋白mRNAs水平。

有關(guān)嘔吐毒素調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白及其腸道m(xù)RNA的分子作用機(jī)制的文獻(xiàn)仍然極少。大量證據(jù)表明，claudin等緊密連接蛋白可能受參與MAPKs信號傳遞通路級聯(lián)活化作用的信號傳遞分子調(diào)節(jié)。在一項新的研究中，Pinton等（2012）發(fā)現(xiàn)，由于暴露于10 μM 15-ADON（即嘔吐毒素的乙?；问剑┫?8 h，豬腸道細(xì)胞株（即IPEC-1）對claudin-3和claudin-4的表達(dá)下降。此外，同一研究結(jié)果表明，嘔吐毒素及其乙?；苌锶?-ADON和15-ADON，可提高腸道細(xì)胞中MAPKs信號傳遞通路如p38、c-Jun-N-末端激酶（JNK）以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2的表達(dá)，因此直接意味著嘔吐毒素是腸細(xì)胞中這種重要細(xì)胞信號傳遞通路的刺激劑。在此方面，Pinton等（2010）早先發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素暴露會激活并誘導(dǎo)ERK1/2，并與claudin表達(dá)下降有關(guān)，導(dǎo)致腸道屏障功能下降，這可通過TEER和細(xì)胞旁通透性的測定結(jié)果得到證明。此外，靜脈輸入100 μg/kg體重的嘔吐毒素后，豬空腸中段閉合蛋白帶-1的頂膜表達(dá)下調(diào)。有意思的是，研究表明，嘔吐毒素衍生物的毒性與MAPKs激活水平和claudin蛋白表達(dá)抑制之間存在直接正相關(guān)。顯而易見，在出現(xiàn)毒性最強(qiáng)的乙?；瘒I吐毒素形式（即15-ADON）的情況下，信號傳遞通路級聯(lián)的激活與腸道屏障功能嚴(yán)重在研相關(guān)。這些觀察結(jié)果表明，嘔吐毒素暴露后的腸道屏障功能遭到破壞是一個協(xié)調(diào)一致的過程，它起初以磷酸化MAPKs表達(dá)增加開始，然后是緊密連接蛋白如claudins的表達(dá)下降。

（未完，待續(xù)）

原題名：Impacts of the feed contaminant deoxynivalenol on the intestine of monogastric animals： poultry和swine（英文）

原作者：Khaled Ghareeb和Wageha A.等